反应，不会产生菌群失调、耐药菌住的弊病，适合各类人群使用，包括幼儿和孕妇；
(5)本发明所述的三价病毒抗体对病毒灭活效果好，且对活体生物的表面和眼球均无刺激性，停留在喷涂部位的时间长。
【附图说明】
[0020]图1为本发明中方法的流程图。
【具体实施方式】
[0021]下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此，在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。
[0022]实施例:
本实施例中的三价病毒抗体为三价抗手足口病病毒的鸡卵黄抗体，所述三价手足口病病毒包括 EV71、CoxAlO、CoxA16。
[0023]该三价病毒抗体的具体制备方法，如图1所示，包括如下步骤:
Cl)分别将EV71、CoxAlO及CoxA16手足口病毒株接种于Vero细胞中，并将接种有病毒株的Ve1细胞置于33~36°C培养箱中，培养5~7天，待细胞出现病变时收获病毒液，根根据收货的病毒液确定CCID50具体数值，使用0.2-0.4%甲醛进行灭活，经离心、纯化后置于
2-80C的温度环境中备用；根据CCID50结果，将EV71、CoxA1及CoxA16分别用缓冲液稀释，分别与等量的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂配制成乳化免疫抗原。
[0024](2)取健康适龄的产蛋母鸡，在产蛋母鸡的翅基部三角肌或胸肌等位置用步骤(I)中获取的免疫抗原进行肌肉、皮下多点注射，以使产蛋母鸡产生更好的免疫反应；其中首次免疫采用弗氏完全佐剂，其余采用弗氏不完全佐剂；首次免疫28天后免疫第2次，以后每间隔28天免疫一次，每次免疫剂量为0.5~lml/只。
[0025](3)收集免疫母鸡下的免疫鸡蛋，之后对免疫鸡蛋的蛋黄进行如下的提取、纯化步骤:
(3.1)将免疫后收集的鸡蛋清洗干净、破壳，分离蛋清蛋黄，去除蛋清，收集蛋黄称取重量;
(3.2)将蛋黄按1:6~9比例加入纯化水稀释匀浆，用lmol/L盐酸溶液调pH4.8-5.5，并在2~8°C的温度条件下静置1~24小时；
(3.3)静置后的液体进行4000~20000r/min的离心，从而去除沉淀物、取上层清液；
(3.4)将获取的上层清液中加入10%~35%硫酸铵盐析，使其充分混匀，之后过夜沉淀；(3.5)沉淀完成后，进行4000~20000r/min的离心脱盐，取得沉淀制得卵黄抗体粗提物，去除硫酸钱上层清液；
(3.6)获取的卵黄抗体粗提物用1/150~1/300体积弱酸性缓冲液复溶，调节pH为
4.8-5.5，令其充分溶解，并在2~8°C的温度环境过夜，之后获取上层清液；
(3.7)将获取的上层清液用截留相对分子量为50~100kD超滤膜进行超滤；
(3.8)将超滤后的溶液放置在温度为54~60°C的环境中，保持8~20小时，进行病毒灭活；
(3.9)进行灭活后的溶液，取其上层清液，剩余的悬浊液进行4000~20000r/min的离心分离，除去沉淀，获得的上层清液进行合并，获得单型抗体原液。
[0026](4)将获得三种单型抗体原液按照抗体效价检测配加稳定剂，从而获得抗三价手足口病病毒的鸡卵黄抗体。
[0027]其中，步骤(4)中，对三种单型抗体原液进行效价检测，具体方法包括细胞法和ELISA 法。
[0028]使用细胞法对三种单型抗体原液进行效价检测的方法:所述细胞法检测三种单型抗体的效价方法为:消化并分散RD细胞，调节细胞悬液浓度2X 105/ml左右，待检样品从1:8开始进行倍比稀释至1:64 ;将EV71、CoxA16、CoxAlO型病毒分别稀释为100TCID50备用，取稀释的病毒液，按照体积比1: 1，分别与稀释的待检样品混匀，接种于96孔板中，置36°C中和2小时；加入浓度为2 X 15个/ml的RD细胞悬液0.1ml，置细胞培养箱中36°C孵育5-7天，显微镜下观察细胞病变；待检样品出现100%CPE判为阴性，50%以上细胞出现保护者为阳性；能抑制50%细胞病变的最高稀释度即为该待检样品的中和抗体效价。
[0029]测得的抗体效价:EV71彡 1:32，CoxA16 彡 1:32，CoxAlO 彡 1:32。
[0030]实施例2:
本实施例在上述实施例的基础上，使用ELISA法三种单型抗体原液进行效价检测，测得抗体效价:EV71彡1:32，CoxA16彡1:32，CoxAlO彡1:32。本实施例其他部分与上述实施例相同，这里不再赘述。
[0031]实施例3:
本实施例在上述实施例的基础上，为验证所述的三价病毒抗体的有效性，对获取的抗三价手足口病病毒的鸡卵黄抗体进行了病毒灭活实验，具体过程如下:
用滴度为105~107的手足口病病毒EV71、COXA16、COXA10型悬液分别与3%牛血清白蛋白进行对倍稀释，取稀释后的手足口病病毒EV71、CoxA16、CoxAlO型悬液0.2ml分别加入到无菌试管中，再加入0.8ml获取的抗三价手足口病病毒的鸡卵黄抗体，混匀，然后放置在200C ±1°C水浴中作用5min、10min和20min。振荡混合后，取样检测残留手足口病病毒滴度。手足口病病毒EV71、CoxA16、CoxAlO平均灭活对数值不低于1.0log。
[0032]本实施例的实验充分验证了所述三价病毒抗体的有效性，该三价病毒抗体对手足口病病毒EV71、CoxA16、CoxAlO平均灭活对数值较高，实际使用中，具有较好的病毒免疫效果。本实施例其他部分与上述实施例相同，这里不再赘述。
[0033]实施例4:
本实施例在上述实施例的基础上，为验证所述的三价病毒抗体在生物活体表面的安全性，对获取的抗三价手足口病病毒的鸡卵黄抗体进行了多次完整皮肤刺激试验。
[0034]具体试验过程如下:
试验前24h，将家兔背部脊柱两侧被毛剪掉，去毛范围左、右各约3cmX3cm。试验时将抗三价手足口病病毒的鸡卵黄抗体原液0.5ml涂于一侧2.5cmX2.5cm皮肤上，另一侧皮肤作为空白对照。在涂抹后4h除去鸡卵黄抗体原液，每天涂抹一次，连续涂抹14d。在每次涂抹后24h观察结果，对家兔多次完整皮肤刺激试验结果为无刺激性。
[0035]本实施例的实验充分证明了，所述的三价病毒抗体对生物活体的皮肤表面没有刺激性，在实际使用中，涂抹在生物活体表面具有很好的安全性，本实施例其他部分与上述实施例相同，这里不再赘述。
[0036]实施例5:
本实施例在上述实施例的基础上，为验证所述的三价病毒抗体在活体生物眼球表面的安全性，对获取的抗三价手足口病病毒的鸡卵黄抗体进行了急性眼刺激试验。
[0037]具体试验过程如下:
取抗三价手足口病病毒的鸡卵黄抗体原液0.1ml滴入家兔右眼结膜囊内，被动闭合4s, 30s后用足量、流速较快但又不会引起动物眼损伤的生理盐水冲洗30s，左眼为空白对照。记录滴眼后比、2411、4811、7211、7(1、14(1和21(1的局部反应。如果72h内未出现刺激反应，或第7d、第14d，眼睛刺激反应完全恢复，即可提前终止试验。试验结果表明，抗三价手足口病病毒的鸡卵黄抗体原液对家兔急性眼刺激试验结果无刺激性。
[0038]本实施例的实验充分证明了所述的三价病毒抗体，在触及生物活体的眼球时，对眼球无刺激性，在实际使用中，不用担心因操作不适，导致该抗体溶液进入人眼，而引发人眼的不适，