进一步体现该三价病毒抗体在活体应用方面的安全性，本实施例其他部分与上述实施例相同，这里不再赘述。
[0039]实施例6:
本实施例在上述实施例的基础上，为验证所述的三价病毒抗体的在活体生物不同部位的停留时间长，对获取的抗三价手足口病病毒的鸡卵黄抗体进行了药物停留时间小动物成像实验。
[0040]具体试验过程如下:
调制pH至8.5-10.0，将少量荧光染料加入到抗三价手足口病病毒的鸡卵黄抗体原液中，温度为4°C，垂直混合过夜。然后超滤离心来去除未反应的荧光分子，获得含有荧光分子的抗三价手足口病病毒的鸡卵黄抗体原液。
[0041]试验方法:将含有荧光分子抗三价手足口病病毒的鸡卵黄抗体原液制成口腔喷雾。分成三组实验组:a组:喷雾后禁水8小时，不禁食；b组:喷雾后禁食8小时，不禁水；c组:喷雾后禁水禁食8小时；皮肤喷涂:背部剔除部分皮毛后进行喷雾。
[0042]通过小动物成像采集喷雾部位荧光强度，通过荧光强度减弱情况，判断抗三价手足口病病毒的鸡卵黄抗体原液在喷雾部位的停留时间，口腔喷雾后，不同组别的抗三价手足口病病毒的鸡卵黄抗体原液的荧光随时间减弱，口腔喷雾后，不同试验组别在口腔的停留时间均能达到8.5小时，其中禁食禁水实验组效果比较好。含有荧光分子的抗三价手足口病病毒的鸡卵黄抗体原液在皮肤处停留时间可长达70多小时。
[0043]本实施例的实验是为了验证该三价病毒抗体喷涂在活体动物表面或者口腔内，停留的时间均能达到8小时以上，具有较长的保护周期，在实际使用过程中，可以准确的预测该三价病毒抗体的喷涂时间。本实施例其他部分与上述实施例相同，这里不再赘述。
[0044]尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解:在不脱离本发明的原理和宗旨下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
【主权项】
1.一种三价病毒抗体，其特征在于:所述三价病毒抗体为三价抗手足口病病毒的鸡卵黄抗体，所述手足口病病毒包括EV71、CoxA10、CoxA16。
2.根据权利要求1所述三价病毒抗体的制备方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)分别制备病毒EV7l、CoxA10、CoxA16的免疫抗原； (2)将步骤(I)中获得的三种免疫抗原分别注入到不同的母鸡体内； (3)收集免疫母鸡下的免疫鸡蛋，并对免疫鸡蛋的蛋黄进行提取、纯化，从而分别获得三种单型抗体原液； (4)将获得三种单型抗体原液按照抗体效价检测配加稳定剂，从而获得抗三价手足口病病毒的鸡卵黄抗体。
3.根据权利要求2所述的三价病毒抗体的制备方法，其特征在于:所述步骤(I)中，制备相应病毒的免疫抗原具体过程为:分别将EV71、CoxAlO及CoxA16手足口病毒株接种于Vero细胞中，并将接种有病毒株的Vero细胞置于33~36°C培养箱中，培养5~7天，待细胞出现病变时收获病毒液，根根据收货的病毒液确定CCID5tl具体数值，使用0.2-0.4%甲醛进行灭活，经离心、纯化后置于2~8°C的温度环境中备用；根据CCID5tl结果，将EV71、CoxAlO及CoxA16分别用缓冲液稀释，分别与等量的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂配制成乳化免疫抗原。
4.根据权利要求3所述的三价病毒抗体的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中将三种免疫抗原分别注入到不同的母鸡体内的具体过程为:取健康适龄的产蛋母鸡，在产蛋母鸡的翅基部三角肌或胸肌等位置用乳化好的免疫抗原进行肌肉、皮下多点注射，以使产蛋母鸡产生更好的免疫反应；其中首次免疫采用弗氏完全佐剂，其余采用弗氏不完全佐剂；首次免疫28天后免疫第2次，以后每间隔28天免疫一次，每次免疫剂量为0.5~lml/只。
5.根据权利要求2或3或4所述的三价病毒抗体的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)中，分离、提纯的具体步骤如下: (3.1)将免疫后收集的鸡蛋清洗干净、破壳，分离蛋清蛋黄，去除蛋清，收集蛋黄称取重量; (3.2)将蛋黄按1:6~9比例加入纯化水稀释匀浆，用lmol/L盐酸溶液调pH4.8-5.5，并在2~8°C的温度条件下静置1~24小时； (3.3)静置后的液体进行离心，从而去除沉淀物、取上层清液； (3.4)将获取的上层清液中加入10%~35%硫酸铵盐析，使其充分混匀，之后过夜沉淀； (3.5)沉淀完成后，进行离心脱盐，取得沉淀制得卵黄抗体粗提物，去除硫酸铵上层清液； (3.6)获取的卵黄抗体粗提物用1/150~1/300体积弱酸性缓冲液复溶，调节pH为4.8-5.5，令其充分溶解，并在2~8°C的温度环境过夜，之后获取上层清液； (3.7)将获取的上层清液用超滤膜进行超滤； (3.8)将超滤后的溶液进行病毒灭活； (3.9)进行灭活后的溶液，取其上层清液，剩余的悬浊液进行离心分离，除去沉淀，获得的上层清液进行合并，获得单型抗体原液。
6.根据权利要求5所述的三价病毒抗体的制备方法，其特征在于:所述病毒抗体的分离、提纯步骤中，进行离心的离心参数为4000~20000r/min。
7.根据权利要求5所述的三价病毒抗体的制备方法，其特征在于:所述步骤(3.7)中超滤使用的超滤膜的截留相对分子量为50~100kD。
8.根据权利要求5所述的三价病毒抗体的制备方法，其特征在于:所述步骤(3.8)中超滤后溶液的病毒灭活方法为:将需要病毒灭活的溶液放置在温度为54~60°C的环境中，保持8~20小时。
9.根据权利要求2或3或4所述的三价病毒抗体的制备方法，其特征在于:所述步骤(4)中，对获得三种单型抗体进行效价检测的方法为细胞法或ELISA法。
10.根据权利要求9所述的三价病毒抗体的制备方法，其特征在于:所述细胞法检测三种单型抗体的效价方法为:消化并分散RD细胞，调节细胞悬液浓度2 X 105/ml左右，待检样品从1:8开始进行倍比稀释至1:64 4fEV71、CoxA16、CoxA10型病毒分别稀释为10TCID5q备用，取稀释的病毒液，按照体积比1:1，分别与稀释的待检样品混匀，接种于96孔板中，置36°C中和2小时；加入浓度为2 X 15个/ ml的RD细胞悬液0.1ml，置细胞培养箱中36 °C孵育5-7天，显微镜下观察细胞病变；待检样品出现100%CPE判为阴性，50%以上细胞出现保护者为阳性；能抑制50%细胞病变或能保护50%细胞不产生病变的最高稀释度即为该待检样品的中和抗体效价。
【专利摘要】本发明公开了一种三价病毒抗体及其制备方法，所述三价病毒抗体为三价抗手足口病病毒的鸡卵黄抗体，所述三价手足口病病毒包括EV71、CoxA10、CoxA16。其制备方法包括以下步骤：（1）分别制备病毒免疫抗原；（2）将三种免疫抗原分别注入到不同的母鸡体内；（3）收集免疫母鸡下的免疫鸡蛋，并对免疫鸡蛋的蛋黄进行提取、纯化，分别获得三种单型抗体原液；（4）将获得三种单型抗体原液按照抗体效价检测配加稳定剂，获得鸡卵黄抗体。本发明中的三价病毒抗体可中和三型病毒抗原，保护范围覆盖更广；配置的三型抗体原液中的单型抗体可独立发挥抑杀抗原的作用；生物活性稳定，可长时间保存，效价高；该三价病毒抗体安全性好。
【IPC分类】C07K16-02, C07K16-10
【公开号】CN104817640
【申请号】CN201510269185
【发明人】林小军, 叶琳, 朱玲, 李燕, 何丽珊, 万强, 何珊, 叶向阳, 蔡仲 , 林烨暄
【申请人】成都安蒂康生物科技有限公司
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年5月25日