390- A FAD2-sense-FUWA。
[0060](三）用限制性内切酶Pst I酶切重组质粒pCUbil390- A FAD2-sense-FUWA，回收 约12689bp的线性质粒，得到载体大片段。
[0061](四)PstI酶切步骤二的(三)得到的PCR产物，得到基因片段；将基因片段与步骤 (三）得到的载体大片段连接，得到重组质粒，记作pCUbil390- A FAD2-FUWA。
[0062] 根据测序结果，对重组质粒pCUbil390- A FAD2-FUWA进行结构描述如下：骨架载 体为pCUbil390- A FAD2载体，在其Kpn I酶切位点插入了 SEQ ID No. 2中自5'末端起第 965至1415位核苷酸所示的DNA片段，在其Pst I酶切位点插入了 SEQ ID No. 2中自5'末 端起第965至1415位核苷酸所示的DNA片段的反向互补序列。
[0063] 实施例2、转基因水稻的获得
[0064] 一、将重组质粒pCUbil390- A FAD2-FUWA导入根癌农杆菌EHA105,得到重组农杆 菌 EHA105/pCUbil390- A FAD2-FUWA。
[0065] 二、FUWA基因抑制表达水稻的获得
[0066]将 EHA105/pCUbil390_ A FAD2-FUWA 转入水稻 Nipponbare (Oryza sativa)(以 下简称野生型水稻）胚的愈伤组织中，具体步骤如下：
[0067](一）用含50μmol/L卡那霉素的液体LB培养基悬浮重组农杆菌EHA105/ pCUbil390- A FAD2-FUWA，得到 0D6(l(lnm ~0? 5 的菌悬液。
[0068](二)取野生型水稻的成熟胚愈伤组织与步骤(一）得到的菌悬液混合，侵染30min， 用滤纸吸干菌液后将愈伤组织放置于共培养培养基(含0. 〇3924mg/L乙酰丁香酮的固体N6 培养基）上，24°C培养3天。
[0069](三）将步骤(二）得到的愈伤接种至含150mg/L G418的固体N6培养基上，24°C培 养16天。
[0070] (四）取步骤(三）得到的健康愈伤组织，接种至含200mg/L G418的固体N6培养基 上，24°C培养，每15天继代一次。
[0071](五)取步骤（四）得到的健康愈伤组织，接种至分化培养基(含150mg/L G418、2mg/ L激动素、0. 05mg/L萘乙酸的固体N6培养基)上，24°C培养45天(此时植株地上部分高度约 为15cm)，打开瓶口炼苗3天，然后移栽至温室栽培，即为I；代植株。
[0072] (六）将L代植株自交，收获种子并培育为植株，即为代植株。
[0073](七）提取T。代植株和代植株的基因组DNA。
[0074] (八)分别以步骤(七)得到的T。代植株和1\代植株的基因组DNA为模板，以1390-F 和FAD2-R为引物进行PCR扩增。
[0075] 引物如下：
[0076] 1390-F :5'-TGCCTTCATACGCTATTTATTTGC-3' ；
[0077] FAD2-R :5, -GAAGCGACGGACCTGGAGAT-3,。
[0078] 1390-F对应于图1的10707-10730bp, FAD2-R引物对应于图1中的第 10827-10846bp,如果PCR扩增出大小约为728bp的条带，则说明为植株为阳性转基因植株。
[0079] 对于某一I；代植株，如果该植株及其代植株PCR鉴定均为阳性，该植株为纯合 的FUWA基因抑制表达植株，该植株及其自交后代为一个FUWA基因抑制表达株系，共得到10 个FUWA基因抑制表达株系。
[0080] 三、转空载体水稻的获得
[0081]用 pCUbil390- A FAD2 载体代替重组质粒 pCUbil390- A FAD2-FUWA 进行步骤一 和步骤二，得到转空载体（pCUbil390- A FAD2)的水稻。
[0082] 四、植株的mRNA表达量的检测
[0083] 为了验证转基因后代的FUWA基因被抑制程度，利用实时定量PCR来检测野生型 水稻、转空载体（pCUbil390- A FAD2)的水稻以及FUWA基因抑制表达株系体内FUWA基因 的表达情况。实时定量PCR在定量PCR仪（7900real_time，Applied Biosystems)上按照 Applied Biosystems提供的操作步骤进行，以水稻Ubiqutin基因作为反应中的内参。引物 在60°C退火，反应40个循环，每个样品设置三个重复。反应体系为25 ii 1,其中包括2 ii 1 各植株的mRNA的反转录产物、0. 25 ii M的正反向引物和12. 5 ill SYBRGreen混合物(购自 Takara)。
[0084] 实时定量PCR鉴定所使用的引物如下：
[0085] Qrt-F :5'-AGCAACATTGTGCGAATAACTCC-3'；
[0086] Qrt-R :5' -TTCCTGTATCATCCACGGCAA-3'。
[0087] 结果表明，与野生型水稻、转空载体的水稻相比，FUWA基因抑制表达株系中的 FUWA基因被显著抑制。
[0088] 实施例3、水稻的表型以及农艺性状的统计
[0089] 一、将FUWA基因抑制表达T2代株系的水稻和转空载体的水稻在抽穗灌浆后，对水 稻的形状、粒形和穗型进行性状考察和拍照。
[0090] 结果如图2所示。
[0091] 图2中，WT代表野生型水稻；fuwa代表FUWA基因抑制表达T2代株系。
[0092] 图2A为水稻的形状，图2B为水稻的粒形，图2C为水稻的穗型。
[0093] 图2表明，与野生型水稻相比，FUWA基因抑制表达水稻的穗型紧凑且直立，稻粒的 粒宽显著增加，粒长减少。
[0094] 二、当各水稻籽粒成熟后，收获烘干后在室温下保存3个月，集成糙米，用于稻米 粒长测定。
[0095] 参照《中华人民共和国国家标准》GB/T17981-1999，进行水稻糙米和稻谷的粒型测 定，重复3次，取平均值作为性状表型值。
[0096] 随机挑选各水稻1000粒饱满水稻稻粒，用千分之一电子天平称重，重复三次，取 平均值作为千粒重表型值。
[0097] 结果如图3所示。
[0098] 图3中，WT代表野生型水稻；fuwa代表FUWA基因抑制表达T2代株系。
[0099] 图3J为稻粒的粒长，图3K为稻粒的粒宽，图3L为稻粒的粒厚，图3M为1000粒饱 满水稻稻粒的千粒重。
[0100] 图3表明，与野生型水稻相比，FUWA基因抑制表达水稻的粒长显著减少、稻粒的粒 宽、粒厚以及粒重显著增加。
[0101] 三、对实施例2得到的转空载体pCUbil390-AFAD2的水稻以及三株编号为GR-5、 GR-7和GR-10的FUWA基因抑制表达T2代株系进行上述实验，部分结果如表1与图4所示。
[0102] 表1转基因植株后代粒型相关性状的统计
[0103]
【主权项】
1. 一种蛋白，为如下（1)或（2)所示： (1) SEQ ID No. 1所示的蛋白； (2)将SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且功能相同的蛋白质。
2. 权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下中至少一种： 1. SEQ ID No. 2所示的DNA分子； 2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子； 3)与1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质 的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5. -种干扰载体，该载体是将SEQ ID No. 2中自5'末端第965至1415位核苷酸所 示的DNA片段插入pCUbil390- A FAD2载体的Kpn I酶切位点，得到中间载体；将SEQ ID No. 2中自5'末端第965至1415位核苷酸所示的DNA片段的反向互补序列插入中间载体的 Pst I酶切位点，最终得到干扰载体。
6. -种改变植物籽粒性状的方法，包括如下步骤：使植物中的权利要求1所述蛋白的 表达或活性被抑制、或植物中的权利要求2或3所述基因的表达被抑制，进而增加植物籽粒 的粒宽、粒厚和/或粒重，和/或减少植物籽粒的粒长。
7.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述使植物中的权利要求1所述蛋白的 表达或活性被抑制、或植物中的权利要求2或3所述基因的表达被抑制的方法包括如下步 骤：将权利要求5所述的干扰载体导入出发植物中，得到转基因植物。
8. 根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述植物为水稻。
9.抑制权利要求1所述蛋白的表达或活性的物质在提高植物粒宽，粒厚，粒重，穗型紧 凑、直立程度和/或缩短粒长中的应用； 和/或， 抑制权利要求2或3所述基因表达的物质在提高植物粒宽，粒厚，粒重，穗型紧凑、直立 程度和/或缩短粒长中的应用； 所述植物具体为水稻。
10. 权利要求5所述的干扰载体在提高植物粒宽，粒厚，粒重，穗型紧凑、直立程度和/ 或缩短粒长中的应用； 所述植物具体为水稻。
【专利摘要】本发明公开了一种FUWA基因及其应用。本发明公开的一种蛋白，为如下（1）或（2）所示：（1）SEQ ID No.1所示的蛋白；（2）将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。与野生型水稻相比，FUWA基因表达抑制水稻的粒宽和粒厚显著增加，粒长减少，粒重增加，穗型由原来的松散穗型改变为紧凑且直立的穗型。细胞学观察表明FUWA基因表达抑制的水稻颖壳和穗基部横向细胞分裂显著增加。本发明对于进一步阐明植物花序和小花发育分子机理并通过基因工程手段培育优质、高产的作物新品种具有重要的理论意义和现实意义。
【IPC分类】C12N1-15, C12N15-29, C12N5-10, A01H5-00, C12N1-21, C12N15-82, C12N1-19, C07K14-415
【公开号】CN104844701
【申请号】CN201410053015
【发明人】万建民, 陈隽, 高赫, 翁建峰, 金名捺, 吴赴清, 王久林, 王洁, 张欣, 郭秀平
【申请人】中国农业科学院作物科学研究所
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2014年2月17日