0018] 获得引物： 表1引物序列
阳性对照品的制备 采用市售商品化试剂盒提取阳性犬瘟热病毒和犬冠状病毒细胞培养物的核酸，用Mix PCR 反应液管分别扩增犬瘟热病毒和犬冠状病毒DNA，反应分别能扩增出一条550 bp和225 bp 左右的条带。用胶回收试剂盒回收扩增的目的条带，利用分光光度计测定回收的核酸的浓 度。分别将其与PMD18-T载体进行连接反应，4° C连接过夜，将连接产物转化至JM109感 受态细胞，抗性筛选、摇菌、PCR鉴定阳性者，提取重组质粒，测序验证，获得含目的片段的重 组质粒PMD18-T-⑶V和PMD18-T-CCV，将两种病毒的阳性质粒等比例混合，分装每支50 μ L,浓度控制在80 - I00ng/PL。
[0019] 阴性对照品的制备 采用市售商品化核酸提取试剂盒分别提取无犬瘟热病毒和犬冠状病毒感染犬肌肉组织的 DNA。用灭菌去离子水稀释，将浓度控制在80 - lOOng/μ L，分装为每支50 μ L。
[0020] 制备待检样品的核酸模板 取100 μ L - 200 μ L或IOOmg - 200mg待检样品，采用市售商品化核酸提取试剂盒提 取样品中的基因组，反转录后即为核酸模板。
[0021] 扩增体系的建立和优化 以标准阳性毒株核酸为模板，在非严谨的条件下进行扩增，优化扩增的退火温度，然后 在优化的退火温度下，优化反应体系中的Mg2+浓度、引物浓度、PCR缓冲液浓度和Taq酶浓 度。优化的 Mix PCR 反应液中包含：10XPCR buffers 2.5 μ L，25 mmol/L MgC12 2μ L，lOmmol/L dNTP I μ L, Taq DNA 聚合酶 0.3 μ L, 10 μ mol/L 引物 SEQ ID NOU SEQIDN02、SEQIDN03、SEQIDN04各0·5μL，灭菌双蒸水14·2μL0在优化的退火温 度和循环条件下，两个体系可以实现对犬瘟热病毒和犬冠状病毒的鉴定。优化的Mix PCR 反应液的扩增条件是： 预变性：95 ° C 5 min ; 循环：95。C 5分钟；循环：94。C变性45秒，58。C退火30秒，72° C延伸45 秒，35个循环；延伸72 ° C 10分钟；:4 ° C保存。
[0022] 特异性和灵敏度 采用上述优化的体系和扩增条件，对标准阳性犬瘟热病毒和犬冠状病毒、犬细小病毒、 犬腺病毒2型、犬副流感病毒、健康犬组织等核酸提取物进行扩增，均无非特异性扩增条 带。
[0023] 用灭菌去离子水梯度稀释阳性质粒DNA，用上述优化的体系和扩增条件扩增，本发 明的最低检测限分别约为〇. lng。
[0024] 试剂的制备 Mix PCR 反应液：10 X PCR buffers 2. 5 μ L, 25 mmol/L MgC12 2 μ L, 10 mmol/ LdNTP I μ L, Taq DNA 聚合酶 0.3 μ L，10 μ mol/L 引物 SEQ ID NOU SEQ ID N02、 SEQ IDN03、SEQ ID N04各0. 5 yL，灭菌双蒸水14. 2 μ L，共22 μ L，每个试剂盒提供足 做48个反应的量共22 X 48=1056 μ L〇
[0025] 试剂盒的组装 如上所配制的阳性对照、阴性对照各1支，Mix PCR反应液1支，灭菌去离子水2支，贴 上生产日期及产品标签。低温保存及运输。
【主权项】
1. 一种犬瘟热和犬冠状病毒双重PCR检测试剂盒，其特征是：它包括Mix PCR反应液 管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，其中：所述Mix PCR反应液管由以下反应 液组成： 序列为SEQID NO. 1的10 mmol/L的上游引物0. 5 iiL; 序列为SEQID NO. 2的10 mmol/L的下游引物0. 5 iiL; 序列为SEQID NO.3的10 mmol/L的上游引物0. 5 iiL; 序列为SEQID NO.4的10 mmol/L的下游引物0. 5 iiL; 10XPCRbuffer缓冲液2. 5iiL ; 25mmol/LMgC12 2uL； 10mmol/LdNTPIuL； 5U/iiL Taq DNA聚合酶 0?3iiL ; 灭菌水14. 2iiL;合计22iiL,为单次反应的用量； 所述阳性对照管：管内为犬瘟热病毒和犬冠状病毒各自的重组质粒，比例为1:1，2y L一 20uL,其DNA.序列如下： 犬瘟热病毒重组质粒PMD18-T-CDV的DNA序列为SEQID NO.5; 犬冠状病毒重组质粒PMD18-T-CCV的DNA序列为SEQID NO.6; 所述阴性对照管：管内为无犬瘟热病毒和犬冠状病毒感染的犬肌肉组织DNA样品，2iiL一 20yL;所述灭菌去离子水管：1 一 2mL。2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征是：所述犬瘟热病毒和犬冠状病毒在同一PCR 反应体系中进行特异性扩增，根据扩增片段的大小，将犬瘟热病毒和犬冠状病毒鉴别与区 分。3. -种采用权利要求1所述试剂盒用于的犬瘟热和犬冠状病毒双重PCR疾病诊断目的 的检测方法，步骤如下： (1) 制备待测样品核酸模板取100UL- 200iiL或IOOmg- 200mg待检样品，用 商品化核酸提取试剂盒或实验室常规使用的提取病毒核酸的方法提取待检样品中的基因 组DNA，即为待测样品核酸模板； (2) PCR扩增检测：取3 y L待测样品核酸模板和阴性对照管，或3 y L待测样品核酸 模板和阳性对照管，分别用Mix PCR反应液管进行PCR扩增；PCR扩增条件是：预变性：95 °C 5分钟；循环：94°C变性45秒，58°C退火30秒，72° C延伸45秒，35个循环； 延伸72°C 10分钟； (3) 结果判定：在550bp和225bp位置有两条扩增条带，分别为犬瘟热病毒和犬冠状 病毒特异性扩增条带，表示犬瘟热病毒和犬冠状病毒呈阳性；在这两处位置无可见扩增带， 表示犬瘟热病毒和犬冠状病毒呈阴性。
【专利摘要】本发明公开了一种用于犬瘟热和犬冠状病毒双重PCR检测试剂盒和用于犬瘟热和犬冠状病毒快速鉴别检测的双重PCR方法。根据犬瘟热病毒和犬冠状病毒的基因组序列各设计一对PCR引物，可以扩增出相对应的特异性片段，实现对犬瘟热病毒和犬冠状病毒的检测与鉴别。本发明利用双重PCR技术，单管同步检测犬瘟热病毒和犬冠状病毒，降低了对犬瘟热病毒和犬冠状病毒的检测成本和工作量，实现了对犬瘟热病毒和犬冠状病毒的鉴别检测。本发明建立了一种特异性强、灵敏度高、节时省力并且易于观察结果的双重PCR方法，操作简便，特异性强、灵敏度高、可重复性高，且没有复杂的后处理。
【IPC分类】C12Q1/70, C12Q1/68
【公开号】CN104894290
【申请号】CN201410076305
【发明人】孙园园, 刘骏, 王水明, 王云, 王富海, 张帆, 钱科, 赵鹏, 翟路翀
【申请人】中华人民共和国镇江出入境检验检疫局, 中华人民共和国南京出入境检验检疫局
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月4日