扩链泊洛沙姆及由其形成的含生物材料的热可逆水凝胶和它的医学应用【
技术领域：
】[0001]本发明涉及扩链泊洛沙姆（chain-extendedpoloxamers)。尤其是，本发明涉及由这样的扩链泊洛沙姆制备的热可逆水凝胶。另外，本发明涉及含有生物材料的热可逆水凝胶和它的制备方法、医药应用的应用体系和体外在表面上制备组合物的方法。【
背景技术：
】[0002]术语"泊洛沙姆"指的是一类聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物（首次记载在US3,740,421中），还以商品名"piur〇nicK"或"Lutrol?"（BASFSE的商标）被公知。它们是由亲水的聚乙二醇外段和疏水的聚丙二醇内段组成的嵌段共聚物，即（聚（氧化乙烯）-聚(氧化丙稀）-聚（氧化乙稀））-三嵌段共聚物（(poly(ethyleneoxide)_poly(propyleneoxide)-poly(ethyleneoxide)-tri-blockcopolymers)，其可粗略地由以下结构所概括：[00031[0004]这些嵌段共聚物通过相分离在水中形成溶胶或凝胶。聚乙二醇段溶入水中，而聚丙二醇段则彼此相连。该过程就是所谓的胶束形成。所述胶束在较低温度下呈现相对混乱的状态（溶胶状态），当温度升高时会带来这些胶束的有序排列，这导致了液体的凝固（凝胶状态）（参见AlexandridisP.，HolzwarthJ.F.，HattonT.A.MicellizationofPoly(ethyleneoxide)-Poly(propyleneoxide)-Poly(ethyleneoxide)TriblockCopolymersinAqueousSolutions:ThermodynamicsofCopolymerAssociation(聚（氧化乙烯）_聚（氧化丙烯）_聚（氧化乙烯）三前段共聚物在水溶液中的胶束化：共聚交联的热动力学）.Macromolecules.1994;27(9):2414-25)。因此这样的凝胶也称为热可逆水凝月又（thermoreversiblehydrogels)〇[0005]基于泊洛沙姆的水凝胶已被知晓很长一段时间了（(Cf.J.，SwaffordW.B.:Pluronicsasasuppositorybase(普朗尼克作为检剂基质）.Am.J.Pharm.Sci.Support.PublicHealth.1960;132:301_303)。此外，还记载了泊洛沙姆407(Pluronic'1F127)和六甲撑二异氰酸醋（hexamethylenediisocyanate，HMDI)的扩链聚合物（cf.JiangJ.,MalalR.,LiC.,LinM.Y.,ColbyR.H.,GersappeD.,RafailovichM.H.,SokolovJ.C.,CohnD.:RheologyofThermoreversibleHydrogelsfromMultiblockAssociatingCopolymers(多嵌段交联共聚物的热可逆水凝胶的流变学）.Macromolecules2008;41:3646-3652)〇[0006]由于泊洛沙姆是生物学上惰性的，因此它们很快被用作了药物的栓剂，并且伴随着再生医学的出现，它们还可作为细胞载体（cf.KamilS.H.，EaveyR.D.，VacantiM.P.,VacantiC.A.,HartnickC.:Tissue-engineeredcartilageasagraftsourceforlaryngotrachealreconstruction-Apigmodel(组织工程软骨作为喉气管重建的移植源-猪模型）?Arch.Otolaryngol.2004;130(9):1048-1051)。[0007]这些水凝胶的特性在于所描述的温敏行为（thermo-sensitivebehaviour)。因此结合细胞（incorporatedcells)的微创（minimally-invasive)应用是可能的。后者可以轻易地变成液态。移植后，由于温度发生变化而形成凝胶，使得细胞可以保留在预定位置（cf.CohnD.，LandoG.，SosnikA.，GartyS.，LeviA.:PE〇-PP〇-PE〇-basedpoly(etheresterurethane)sasdegradablereversethermo-responsivemulti-blockcopolymers(基于PE0-PP0-PE0的聚（醚醋尿烧）作为可降解的热可逆多嵌段共聚物）?Biomaterials2006;27(9):1718-1727;NguyenM.K.,LeeD.S.Injectablebiodegradablehydrogels.Macromol.Biosci.2010；10(6):563-579)〇[0008]使用热可逆水凝胶在例如烧伤治疗中是有益的。水凝胶可允许经皮的或局部的活性物质给药并且可在皮肤表面保持较高的湿度，这防止了脱水。并且，水凝胶可相当大程度地附着到受损组织，且具有一定的弹性，因此可避免水凝胶分离以及同时吸收伤口产生的分泌物。通常，水凝胶可促进愈合，因为它们可迅速地在伤口位点变成凝胶状态并在伤口处保持潮湿。[0009]然而大多数的具有低聚合物浓度的泊洛沙姆仅能形成具有较差的机械性能的凝胶，而扩链泊洛沙姆则可获得更为稳定的凝胶。最初的扩链尝试是采用丙烯酸酯（acrylicacidesters)(丙稀酸醋（acrylates))进行的，这使得具有C=C双键的基团与泊洛沙姆相连。此后，进行化学加成反应以使得多个泊洛沙姆基团可以被连接。丙烯酸的衍生物在生理学上是无害的。如果采用二异氰酸酯进行扩链，单个泊洛沙姆通过尿烷基团（urethanemoieties)相连。聚氨醋（Polyurethanes)由于它们的组织相容性已在很长一段时间里用作医用植入体（medicalimplants)。至今存在的缺陷是该材料不能被细胞生物识别，因此直到现在细胞也不能附着该材料。[0010]因此，本发明的目的在于提供基于泊洛沙姆的扩链水凝胶，其既不具有现有技术中已知的缺陷，又适合于医学应用。本发明的另一个目的是提供能够释放生物活性试剂或活性物质的热可逆水凝胶。此外，本发明的目的在于提供含有生物材料和活细胞的热可逆水凝胶，其中，细胞粘附在生物材料上，以及它们的治疗应用。【
发明内容】[0011]上述目的可通过提供根据权利要求1-8的扩链泊洛沙姆、根据权利要求9-21的热可逆水凝胶、根据权利要求22-24的应用体系、根据权利要求25-34的热可逆水凝胶的医学应用和根据权利要求35-36的体外方法而实现。【附图说明】[0012]图la-le展示了测定的由泊洛沙姆制得的热可逆水凝胶的物理性质，该泊洛沙姆通过采用二异氰酸酯进行扩链，其中，泊洛沙姆403或PluronicP123(PMT001)通过采用六甲撑二异氰酸酯进行扩链、泊洛沙姆403(PMT002;BDI-hydr〇gel)通过采用二异氰酸丁酯进行扩链，泊洛沙姆403(PMT003)进通过采用亚甲基二环己基二异氰酸酯（methylenebiscyclohexyldiisocyanate)进行扩链。这些测定作为部分的合作计划在慕尼黑的路德维希马克西米利安大学（LudwigMaximilianUniversity)的药物研宄中心的Dr.W.Friess教授的实验室中完成。[0013]图la中给出了本文中相对浊度对聚合物浓度（wt.%)的绘图，图lb中给出了平均保质期模块对温度的绘图，图lc中给出了平均贯入阻力（meanpenetrationresistance)对温度的绘图，图Id中给出了凝胶强度对温度的绘图，以及图le给出了作为生物材料的蛋白质的平均释放比例对时间的绘图。[0014]图2a和2b示出了说明由经二异氰酸丁酯扩链的泊洛沙姆403组成的热可逆水凝胶（以下称作BDI-hydrogel)在不同聚合物浓度下（2,4%、5%和10%)的细胞存活率。在本文中不同的聚合物浓度，通过采用"存活/死亡-分析法（Live/Dead-Assay)"先按小时测量（在图la中的"Oh"-"5h"列），然后按天测量（在图2b中的"ld"、"2d"和"3d"列），以及最后在一周后测量（在图2b中的"7d"列）。[0015]图3展示了在本发明的热可逆BDI-hydrogel中存在10%、20%或者不存在胶原的情况下，每种情况在1、2、3和7天后的细胞形态。比例尺为200ym;所有图片是在同样的放大程度下获得的。[0016]图4展示的显微照片说明了7天后在本发明的热可逆BDI-hydrogel中存在或不存在胶原I的情况下的eGFP-SCPls的细胞存活率（MW±SD，r=3,n=3)。采用邓氏多项比较试验（multiplecomparisontestbyDunn)的Kruskal-Wallis-统计学提供了不存在胶原I(A)或存在胶原I(B和C)的本发明的热可逆凝胶之间的显著性差异。本文中，a=0.05,*p〈0.05,且林p〈0.01。采用碘化丙啶（PI)染色后的示例性的显微图（底部，10x放大）；比例尺为200ym。[0017]图5给出了eGFP-SCPls细胞在本发明的热可逆BDI-hydrogel中存在或者不存在20%胶原I的情况下7天后在共聚焦激光扫描显微镜下的显像。该图在10x放大（比例尺为200ym;图A)或63x放大（比例尺为500ym;图B)程度下测得。[0018]图6a给出了在存在0&02的BDI-hydrogel中在注射器中培养24h后的氧气饱和度(A)和细胞存活率（B)，"对照组"为不存在0&02的BDI-hydrogel(MW±SD，r=3,n=1)。[0019]图6b给出了在存在0.25mg/mL的Ca02和多种过氧化氢酶浓度的BDI-hydrogel中在注射器中培养24h后的氧气饱和度（A)和细胞存活率（B)(MW±SD，r=3,n=1)。[0020]图6c给出了在存在0.5mg/mL的CaOjPl100U/mL过氧化氢酶的BDI-hydrogel中或当前第1页1 2 3 4 5