；保藏日期为:2013年03月28日；保藏号为:CGMCC No:7403 ;分类命名为:人干细胞样脑胶质瘤细胞株。
[0033]具体实施例
[0034](1)G1335体外培养呈现胶质瘤细胞典型形态
[0035]在DMEM(10% FBS)的培养条件下，G1335细胞贴壁生长，从图1(放大倍数50X)中可以看出，G1335细胞呈现出星形、梭形、多角形和不规则形等胶质瘤细胞的典型形态。
[0036](2)G1335细胞染色体高度突变
[0037]从图2中可以看出，G1335细胞具有典型的肿瘤核型。染色体高度突变，仅有少数染色体G显带基本正常，尚可辨认，其余失去了正常染色体形态，可排除为正常神经干细胞或其它细胞的可能。
[0038](3)G1335的体外生长状况
[0039]将G1335细胞2X 104/ml接种到24孔培养板(lml/孔，即2 X 14/孔)，采用含10% FCS的DMEM培养基培养，每日计数，绘制细胞生长曲线。如图3所示，细胞生长曲线呈S形，接种l-2d为潜伏适应期，细胞增殖速度较慢。第3-5d细胞进入对数生长期，细胞增殖明显加速，与第6d达到顶峰，而后进入平台期，由于细胞密度过高，出现接触抑制，细胞生长速度降低，细胞数量轻度下降。根据生长曲线，细胞进入对数生长期后，倍增时间约为20ho
[0040](4) G1335细胞株表达脑胶质瘤和干细胞表面的标志分子。
[0041]如图4所示，为采用流式细胞术检测G1335细胞的表面分子表达，图5为G1335细胞表达神经干细胞标志nestin，高表达肿瘤干细胞标志⑶133，同时高表达星形胶质细胞标志GFAP。
[0042](5)G1335细胞体外无血清培养
[0043]如图6(放大倍数为100X)所示，将G1335细胞株在无血清的培养基中进行培养，可形成神经球。
[0044](6)G1335细胞株的体内高致癌性
[0045]对G1335和U87异体成瘤的实验显示，U87细胞⑶133阳性率只有1_2%，至少需(0.8-1) X 16才能够在裸鼠皮下致瘤；而G1335细胞仅3 X 10 41d左右就能形成肿瘤，符合肿瘤干细胞的高致瘤性特征，说明G1335裸鼠体内成瘤实验的最小成瘤剂量为3X 104。实验结果参见图7。
[0046](7)将G1335细胞株用于⑶40信号对脑胶质瘤干细胞增殖和血管生成的体内外研宄。
[0047]在裸鼠腋下进行皮下接种，按3X 104/50 μ I/点接种G1335。同一只裸鼠左腋下s⑶40L处理细胞，右侧注射PBS处理的细胞株。⑶40信号能促进G1335细胞在裸鼠体内生长，结果如图8所示。具体分析如下参见如下所述及图9至图12。
[0048]a.sCD40L(50ng/ml)刺激 G1335 细胞，分别于 24h，48h 收集上清，ELISA 检测 VEGF分泌，结果如图9所示，⑶40信号可以促进G1335分泌VEGF ；
[0049]b.sCD40L(50ng/ml)刺激G1335细胞48h，流式细胞术检测细胞内VEGF表达，结果如图10所示；
[0050]c.取不同处理组G1335细胞在裸鼠皮下成瘤后的肿瘤组织，冰冻切片免疫荧光染色，一抗采用大鼠抗小鼠CD31单克隆抗体，二抗为绿荧光标记抗大鼠单克隆抗体，结果参见图11，从图11中可以看出s⑶40L激发组肿瘤微血管密度明显增高。
[0051]d.针对c中实验采用高倍镜下计数微血管条数，其中**表示P <0.01，差异显著，结果参见图12。
[0052]从上可以看出，G1335细胞用于⑶40信号促进脑胶质瘤干细胞在裸鼠体内肿瘤生长和肿瘤微血管形成。
[0053](8)G1335细胞用于IL_6信号促进脑胶质瘤干细胞生长和迀移的研宄。
[0054]a.1L-6信号能够促进胶质瘤干细胞神经球的形成，如图13所示，其中A、B和C为对照组，D、E和F为CD40激发组，采用sCD40L 50ng/ml。
[0055]b.1L-6促进G1335细胞体外迀移，采用Transwell进行镜检，结果参见图14，从图14中可以看出促增殖效应与SDF-1 α剂量呈浓度依赖性，能被特异性抗体阻断，其中*表示P <0.05，差异显著。图15为分组实验示意图。
[0056](9)G1335细胞株用于脑胶质瘤干细胞对化疗药物耐受性的研宄
[0057]培养体系中加入不同剂量顺铂，24h后采用显微镜进行镜检，放大倍数为40X，结果参见图16。从图16中可以看出，常规脑胶质瘤细胞U87不能耐受长时间、大剂量化疗，细胞几乎完全裂解。G1335细胞具有较强的化疗耐药性，大剂量长时间顺铂处理后仍能保持正常细胞状态。
[0058]综上所述，可以使用本发明为体外可稳定和长期传代的脑胶质瘤干细胞株G1335，用于脑胶质瘤干细胞生长、分化、侵袭、迀移和形成新生血管以及细胞内信号转导等病理机理的体内外研宄和靶向脑胶质瘤干细胞的各种天然药物和合成药物的筛选及作用机理的体内外研宄。
[0059]以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种来源于人的干细胞样脑胶质瘤细胞株，其特征在于:所述细胞株命名为G1335，保藏号为 CGMCC No:7403ο2.根据权利要求1所述的来源于人的干细胞样脑胶质瘤细胞株，其特征在于:所述G1335细胞株的生物学特性为:具有胶质瘤细胞的典型形态；具有染色体高度突变特性；具有形成神经球特性；长期维持体外稳定生长状态；表达脑胶质瘤和肿瘤干细胞表面标志分子；具有高度耐药性和体内成瘤特点；IL_6信号和CD40信号肿瘤环境因素促进G1335生长、迀移和肿瘤血管生成的恶性生物学行为。3.根据权利要求2所述的来源于人的干细胞样脑胶质瘤细胞株，其特征在于:所述胶质瘤细胞的典型形态为:细胞呈现星形、梭形、多角形、不规则形，且细胞贴壁生长。4.根据权利要求2所述的来源于人的干细胞样脑胶质瘤细胞株，其特征在于:所述G1335细胞株表达神经干细胞标志nestin、肿瘤干细胞标志⑶133和星形胶质细胞标志GFAP05.根据权利要求1所述的来源于人的干细胞样脑胶质瘤细胞株的用途，其特征在于:用于建立脑胶质瘤干细胞生长、分化、侵袭、迀移、形成新生血管和细胞内信号转导的细胞模型。6.根据权利要求1所述的来源于人的干细胞样脑胶质瘤细胞株的用途，其特征在于:用于建立为制备靶向脑胶质瘤干细胞的药物筛选提供稳定且重复性好的细胞模型。
【专利摘要】本发明涉及一种来源于人的干细胞样脑胶质瘤细胞株及其用途，该细胞株命名为G1335，保藏号为CGMCC No:7403，具有胶质瘤细胞的典型形态；具有染色体高度突变特性；具有形成神经球特性；长期维持体外稳定生长状态；表达脑胶质瘤和肿瘤干细胞表面标志分子；具有高度耐药性和体内成瘤特点；IL-6信号和CD40信号肿瘤环境因素促进G1335生长、迁移和肿瘤血管生成的恶性生物学行为，能够表达神经干细胞标志nestin、肿瘤干细胞标志CD133和星形胶质细胞标志GFAP。该G1335为关于脑胶质瘤干细胞生长、分化、侵袭、迁移和形成新生血管以及细胞内信号转导等病理机理的体内外研究提供一个稳定可靠的细胞模型；此外还为靶向脑胶质瘤干细胞的各种天然药物和合成药物的筛选及作用机理的体内外研究提供稳定的重复性好的细胞模型。CGMCC No.740320130328
【IPC分类】C12R1/91, C12N5/095, C12Q1/02
【公开号】CN104974986
【申请号】CN201510283679
【发明人】葛彦, 居颂光, 张学光
【申请人】苏州大学
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年5月29日