净后去皮切成小块并煮沸30min，四层-八层纱布过滤，后加入葡萄糖20g和琼脂20g，充分溶解后补水至1L，121°C灭菌20min。将冻干保存的灰葡萄孢霉菌挑取到活化平板上，26°C培养活化5天。将活化后的菌体用无菌刮刀挑取到液体种子培养基中，打碎搅匀，置于26°C下，摇瓶培养72小时(200rpm)。液体种子培养基组成为(每升中含):葡萄糖20g，MgSO40.2g，KC10.5g，KH2PO4 0.8g，谷氨酸单钠盐 3.0g, FeSO4.7Η200.5mg，ZnSO4.7Η202.5mg，CuSO4.5Η204.0mg0
[0022]发酵培养基组成为:蔗糖20/L，一水合柠檬酸6g/L，吐温_8010g/L，玉米粉3g/L，豆油10g/L，山芋粉10g/L。将配置好的发酵培养基分成2组，其中一组不加发酵促进剂，作为空白对照；另一组在培养基中加入发酵促进剂钼酸钠5mmol/L。每组按体积分别接种5%的液体种子，在27.5°C，200转/分振荡培养8天，测得钼酸钠组脱落酸产量为1.26g/L，而不加发酵促进剂的对照组产量为0.77g/L，比对照产量提高了 63.6%。结果如图1所示，A为对照组，B为实施例，添加了钼酸盐的B培养皿中的菌丝体较A培养皿中的菌丝体分散明显O
[0023]实施例2
[0024]菌种活化及种子培养方法同实施例1。发酵培养基组成为:蔗糖30/L，一水合柠檬酸4g/L，吐温-805g/L，玉米粉4g/L，豆油6g/L，山芋粉15g/L。将配置好的发酵培养基分成2组，其中一组不加发酵促进剂，作为空白对照；另一组配制lOOmmol/L钼酸镁溶液，灭菌后在发酵0h、12h、24h、48h时分4次，分别加入发酵液体积2.5%的钼酸镁溶液。这两组的发酵条件为:液体种子接种量10%，培养温度为24°C，200转/分振荡培养10天，测得钼酸镁组脱落酸产量为2.lg/L，而不加发酵促进剂的对照组产量为0.80g/L，比对照产量提高了162.
[0025]实施例3
[0026]菌种活化及种子培养方法同实施例1。发酵培养基组成为:蔗糖10/L，一水合柠檬酸10g/L，吐温-8015g/L，玉米粉5g/L，豆油15g/L，山芋粉5g/L。将配置好的发酵培养基分成2组，其中一组不加发酵促进剂，作为空白对照；另一组加入发酵促进剂0.lmmol/L钼酸以及5mmol/L钼酸亚铁，接种液体种子5%，培养温度为26°C，200转/分振荡培养10天，测得钼酸镁组脱落酸产量为1.7g/L，而不加发酵促进剂的对照组产量为0.84g/L，比对照产量提高了 103.3%。
[0027]实施例4
[0028]菌种活化及种子培养方法同实施例1。发酵培养基组成为:蔗糖40/L，一水合柠檬酸3g/L，吐温-805g/L，玉米浆3g/L，豆油5g/L，山芋粉5g/L。将配置好的发酵培养基分成2组，其中一组不加发酵促进剂，作为空白对照；另一组在培养基中发酵促进剂0.5mmol/L钼酸铵，然后在发酵20h以及30h时分别加入0.5mmol/L钼酸钾溶液作为发酵促进剂。这两组接种液体种子量均为5%，培养温度为28°C，200转/分振荡培养11天，测得加入发酵脱落酸产量为1.88g/L，而不加发酵促进剂的对照组产量为0.74g/L，比对照产量提高了154.1%ο
[0029]除上述实施外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
【主权项】
1.一种提高脱落酸发酵产量的方法，包括以下步骤: 第一步、对灰葡萄孢霉菌进行斜面培养3-5天，培养温度24-30? ; 第二步、经斜面培养的灰葡萄孢霉菌进行种子培养48-72小时，培养温度24-28°C ； 第三步、经种子培养的灰葡萄孢霉菌进行发酵培养8-11天，培养温度24-28?，培养时添加浓度为0.01-200mM的发酵促进剂，所述发酵促进剂为钼酸或钼酸盐中的至少一种； 第四步、经发酵培养的灰葡萄孢霉菌提取纯化，得到高产量的脱落酸。2.根据权利要求1所述提高脱落酸发酵产量的方法，其特征在于:所述第一步中，斜面培养采用PDA平板培养基。3.根据权利要求1所述提高脱落酸发酵产量的方法，其特征在于:所述第二步中，种子培养基的成分按重量百分比如下，葡萄糖1-3%, MgSO4 0.01-0.1%, KCl 0.01-0.1%,KH2PO4 0.01-0.1%，谷氨酸单钠盐 0.1-0.5%, FeSO4.7H20 0.5mg/L，ZnSO4.7Η202.5mg/L，CuSO4.5H20 4.0mg/L，余量的水。4.根据权利要求1所述提高脱落酸发酵产量的方法，其特征在于:所述第三步中，发酵培养基的成分如下，蔗糖或葡萄糖10-40/L，一水合柠檬酸l-10g/L，吐温-801-30g/L，玉米粉或玉米浆l_15g/L，豆油l_25g/L，山芋粉l_15g/L，钼酸盐0.01_200mM。5.根据权利要求4所述提高脱落酸发酵产量的方法，其特征在于:所述钼酸盐为钼酸钠、钼酸钾、钼酸铵、钼酸钙、钼酸亚铁、钼酸镁、钼酸铜、钼酸锌中的至少一种，钼酸盐单独在121°C灭菌25min，在发酵过程中一次或分次添加至发酵培养基中。6.根据权利要求5所述提高脱落酸发酵产量的方法，其特征在于:所述钼酸盐的添加量为 0.01-200mM。7.根据权利要求4所述提高脱落酸发酵产量的方法，其特征在于:将含有灰葡萄孢霉菌的种子培养基以1% -10%的接种量接种至发酵培养基培养。8.根据权利要求1所述提高脱落酸发酵产量的方法，其特征在于:所述第四步中，提取纯化是将发酵后产物离心，收集发酵液，用盐酸调节PH至2-4，用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩后，结晶得广品。
【专利摘要】本发明涉及一种脱落酸的生产方法，尤其是一种提高脱落酸发酵产量的方法，属于生物工程技术领域。本发明的方法包括斜面培养、种子培养及发酵工艺，在发酵工艺中添加钼酸及其盐类的一种或者两种以上的组合，从而提高灰葡萄孢霉菌发酵产天然脱落酸的产量。与现有技术相比，本发明可克服灰葡萄孢霉菌发酵过程中的菌丝结团及发酵液粘度高等问题，提高菌株对氧的利用率，促进脱落酸的生物合成，与原始工艺相比发酵产量提高50.1％-162.5％，脱落酸发酵水平可达2.1g/L以上。本工艺所用发酵促进剂成本低，工艺简单，便于工业应用。
【IPC分类】C12P7/42, C12R1/645
【公开号】CN104988188
【申请号】CN201510429182
【发明人】郑珩, 刘小欢, 劳兴珍, 余永柱, 张彦, 李瑞星
【申请人】中国药科大学
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年7月20日