一种水稻温敏不育基因tms5的功能标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于水稻分子检测领域。具体地说，本发明公开了针对tm巧功能突变位点 设计的的功能标记，该功能标记可用检测水稻样品中是否含有tm巧基因。
【背景技术】
[0002] 水稻两系不育资源的发现及成功应用，为保障我国粮食安全发挥了重要作用。与 =系不育系相比，两系杂交水稻不受恢复基因的限制，配组自由，资源利用率高，使得两系 杂交水稻在产量和米质方面均较=系杂交水稻有较大提升。同时，两系不育系还具有能自 我繁殖的优点。因此，近年两系法杂交水稻在我国发展速度快，种植面积和推广范围迅速扩 大。
[0003] 选育优良的两系不育系，是培育两系杂交水稻的重要前提。传统的两系不育系选 育需要在海南和内地穿梭育种，利用海南冬季的低溫短日照繁殖不育株，内地夏季的高溫 长日照鉴定育性。运种选育方式，具有诸多限制因素。因此，开发两系不育基因的分子标记， 应用于标记辅助选择，将能大大提高不育系的选育效率。其次，由于两系杂交稻种子的价格 和销售利润都明显高于其他水稻种子，使得种子假冒事件时有发生，严重扰乱了种子市场， 给农民造成重大经济损失。另外，由于两系杂交水稻制种过程中，易受溫、光条件的影响， 使不育系自交结实，导致纯度降低，我国规定杂交稻的纯度需>96%，而传统的种植鉴定费 时、费工、结果滞后。还有，水稻两系不育系最早在我国境内发现，为我国的特有种质资源， 且为我国的粮食安全作出重大贡献。国务院多次强调要坚决遏制我国特有种质资源向国外 流失。但是，缺少有效的检测手段防止外流。
[0004] 因此，根据不育基因的DNA序列信息，设计共显性的分子标记，特异性地将含有不 育基因和不含有不育基因的水稻材料区分开，将对两系不育系的分子标记辅助选择、种子 市场的套牌打假、纯度鉴定和种质资源流失管控都具有重要意义。
[0005] 目前，生产上大规模应用的两系按其不育基因来源可分为两类。一类来源于 农星58S，一般被称为含有光敏不育基因（PGM巧的不育系，生产上使用的代表不育系如 培矮64S，7001S。2012年，Ding等和Zhou等分别克隆pms3 (或P/TMS12-1)基因（参 见，A long noncoding 民NA regulates photoperiod-sensitive male sterility,an essential component of hybrid rice, PNAS, 2012, 109:2654 - 2659 和 Photoperiod-and thermo-sensitive genic male sterility in rice are caused by a point mutation in a novel noncoding RNA that produces a small RNA, Cell 民esearch, 2012:1-12.)，农呈 58s中的pms3基因一个碱基G突变为C，导致RNA结构改变，产生不育。
[0006] 另一类来源于安农S-1，常被称为温敏不育基因（TGMS，tms5, ptgms2-l)，代表 的不育系有广占 63s、ZhulS 等。2011 年，Xu 等的文章[Fine mapping and candidate gene analysis of ptgms2-l，the photoperiod-thermo-sensitive genic male sterile gene in rice(0ryza sativa lOfllieor Appl Genet. 2011，122(2) :365-372]中介绍了 将其定位在第二染色体的两个Indel标记间，距离50. 4肺，该区间有10个基因，其中一个 核糖核酸酶z基因被认为是tm巧的候选基因（L0C_0s02gl2290)，在广占63s中，距离起 始密码子7化P的C突变为A，导致密码由TCG变为终止密码子TAG,推测可能是tm巧的 突变位点'〇 2014 年，Zh曰n邑等[Ch曰r曰cteriz曰tion of 曰n RN曰se Z nonsense mut曰tion identified exclusively in environment-conditioned genic male sterile rice, Mol 化eeding(2014) 34:481 - 489]，对多份两系不育系进行了等位型测验和测序分析，发现先 前报道的tms5、tms9和ptgms2-l为等位基因，且溫敏不育系具有共同的序列特征，即在距 离起始密码子70-7化P位置均为TA，而非溫敏不育系材料为GC或TC。同年，Zhou等[RNase ZSiprocesses UbL40mRNAs and controls thermosensitive genic male sterility in rice, NATURE COMMUNICATIONS, DOI: 10. 1038/ncomm巧884]功能互补验证试验结果显示： 70-7化P位置为GC(日本晴）和TC(安农脚型的Tm巧基因均能使安农S-1 UA型）恢复 育性，说明71位C 一 A的突变是导致安农S-1花粉在高溫条件下不育的功能型突变位点。 Tm巧编码产物为RNase ZSi，RNaseZsi可W降解UbL40的mRNA，在tm巧突变体中RNaseZsi 酶失活，无法降解UbL40的mRNA，导致UbL40的mRNA积累，高溫条件下，UbL40表达量高， 导致不育系不育，低溫条件下化L40表达量低，导致可育。文中还根据我国农业部的统计数 据，分析了我国推广的两系杂交水稻，发现我国的两系不育系有71%含有tm巧基因，且运 些不育系配组的杂交稻推广面积占整个两系杂交稻推广面积的83. 8% (约290万公顷）， 运说明当前两系杂交水稻生产上，tm巧较pms3应用更广泛。
[0007] pms3和tm巧的定位、克隆和序列分析工作为设计pms3和tm巧的分子标记奠定了 基础。对于pms3基因，由于与本发明所要标记的基因不同，运里不做详细介绍。
[0008] 对于tm巧基因，2011年杨剑波等[一个与水稻溫敏不育基因tm巧紧密连锁标记 的开发与应用，专利号：zl 20011 1 0326770. 1]开发了一个用于tm巧检测的Indel标记 SJ00USJ001-F :5' ATATTTGGCGCTCTATTCTT 3'，SJ001-R :5' GGCCAAGTGTTATGATCACT 3')， 专利中称：用PCR扩增该标记位点，携有tm巧基因的溫敏核不育系仅扩增出一条38化P的 谱带；携有tm巧基因的溫敏型两系杂交水稻会扩增出大小分别为463bp和387bp的两条谱 带；不携有tm巧基因的水稻（非溫敏型水稻）仅扩增出一条463bp的谱带。2012年，出入 境检验检疫行业标准《两系水稻品种真实性与纯度鉴定DNA分析法》（SN/T 3402-2012)中 设计了 Indel标记tm巧-S2用于检测tm巧基因，尽管SJ001标记和tm巧-S2标记的引物序 列不同，但是扩增的多态位点是一致的，均为tm巧基因起始密码子ATG上游约5肺位置的 78bp缺失位点。应用SJ001和tm巧-S2过程中，我们发现部分非两系不育系如协青早A中 也能扩增出阳性条带。导致运种假阳性结果的原因是运两种标记检测的位点不是导致tm巧 功能缺失的突变位点（后称功能位点）。
[0009] 2011年，曹晓风等在申请号为201110292922.0的专利申请"一种快速便捷 检测水稻溫敏不育系的方法"中设计了两对引物（RMZ-11F :CCTCTGTATCCACGAAGGAT 和 RMZ-11R:CACTCGGAGGTCTACAATCT ;RMZ-13F:GTAATGTCGTAAGGAAATGCCC 和 RMZ-13R:GCGATGACTTGCCGCTGT)用于检测溫敏不育基因，并认为电泳结果中比野生型产物 电泳速度快的为携带不育基因的溫敏不育系；运两对引物均是检测tm巧基因ATG上游-1 至-6位6碱基的缺失。即该标记检测的也不是tm巧的功能突变位点，仍然存在检测假阳 性风险。根据Zhang等[Mol化eeding(2014)34:481 - 489]对多个品种（品系）的tm巧 基因测序结果，可W发现，用RMZ-11和RMZ-13标记检测tm巧基因，会在不含有tm巧基因 的材料如 08EZ01, Hua201, Hua966, L718, R287, R288, Yi R88, W6154, Zaoxian2430 中出现假 阳性结果。
[0010] 2014 年，Zhang 等[参见，Mol deeding (2014) 34:481 - 489]开发 了针对 tm巧 功能突变位点的两个 dCAPS 标记 RZ2F1/R 和 RZ2F2/R(RZ2F1 :ACCGCGCCGCCACCGGGTCGG CCCAAG，RZ2F2 :ACCGCGCCGCCACC GGGTCGGCCGGAG，RZ2R :TGAAGAGGAA CTCCTGCGAGACGG)。 RZ2F1/R和RZ2F2/R的扩增产物均为178bp，但是RZ2F1/R产物中引入了 Sty I酶切位点， 能切开70-72bp位置为GCG的扩增产物（153bp和25bp)，而切不开tm巧基因（70-72bp为 TAG)的扩增产物，RZ2F2/R产物中引入了化nf I酶切位点，能切开70-72bp位置为TCG的 扩增产物，同样无法切开tm巧基因的扩增产物。运种设计通过两次扩增、两次酶切，根据酶 切结果推断