不育系对照一致，说明该单株含有tm巧基因，且纯合，如果和受体亲本一致，说明 不含有Tm巧基因，且纯合，不是不育系。如果含有2个对照的条带，说明该单株基因型为 Tm巧/tms5。如果需要继续回交，则需要选择Tm巧/tms5带型的单株继续回交，如果是自交 后代选择不育系，则选择tm巧型单株。
[0053] 对于两系溫敏水稻的真实性判定，可用含有溫敏不育基因tm巧的不育系（如 1892s)和不含tm巧基因的材料（如93-11)为对照，如果检测样品的带型与1892s-致，说 明含有tm巧基因，为溫敏不育系，如果带型与9311 -致，则不含有tm巧基因。如果含有2 个对照的条带（2条带），就是杂交种子。
[0054] 同时，本标记适用于溫敏不育系配组的杂交种子的纯度检测，W父母本为对照，如 果带型与母本一致，说明是不育系自交的种子，如果带型与父本一致则为父本或其他不含 有tm巧基因的混杂种子，如果含有双亲的两条带型，则为真杂交种。纯度检验结果可按W 下公式计算：
[00 巧]
[0056] 式中：
[0057] P-样品纯度；
[005引 Nt-为检测种子的总粒数；
[0059] 昨一为同时含有父母本带型的种子粒数。
[0060] 有益效果
[0061] 本申请的发明人在试验过程中发现，通常所设计出的引物对tm巧基因突变位点 周边序列的PCR扩增很困难。
[0062] 通过发明人不懈努力，本发明通过引物设计配合反应体系优化，筛选出稳定的针 对tm巧基因的PCR扩增体系。本发明的功能标记用于tm巧基因的分子标记辅助选择、 tm巧型两系杂交水稻及其亲本的真实性和纯度检测时，检测速度快，效果稳定，不会出现假 阳性。本发明中的设计用限制性内切酶直接酶切tm巧的PCR产物，一方面简化了检测流程， 另一方面也可避免假阳性结果的出现。
【附图说明】
[006引 图1为普通PCR体系扩增的结果，
[0064] 其中，泳道1-14分别对应于表4中的序号1-14,泳道15和16为空白水对照，泳道 17 为标准分子量 Marker, DL2000 灯AKARA)。
[0065] 图2为Re-ScaI+Re-94-Rl引物PCR产物和Sea I酶切结果，
[0066] 其中，1和2泳道为Re-ScaI+Re-94-Rl引物PCR扩增产物，3和4泳道为 Re-ScaI+Re-94-Rl引物PCR产物经酶切后结果，3和4泳道的条带，并不比1和2泳道的条 带小。
[0067] 图3为rTaq巧XGC buffer I体系PCR扩增的结果，
[0068] 其中，泳道1-14分别对应于表4中的序号1-14,泳道15和16为空白水对照，泳道 17为标准分子量Marker,化2000灯AKARA)。泳道1、2、3、4和11扩增出较亮的单条带。
[0069] 图4为rTaq巧XGC buffer II体系PCR扩增的结果
[0070] 其中，泳道1-14分别对应于表4中的序号1-14,泳道15和16为空白水对照，泳道 17为标准分子量Marker,化2000灯AKARA)。泳道1、2、3、4、7和8扩增出较亮的单条带。 [007U 图5为服STAT酶巧XPrime buffer体系PCR扩增的结果
[0072] 其中，泳道1-14分别对应于表4中的序号1-14,泳道15和16为空白水对照，泳道 17为标准分子量Marker, DL2000灯AKARA)。各个泳道虽然扩增出目的条带，但是非特异性 扩增的杂带多。
[007引图6为服STAT酶巧X GC buffer体系PCR扩增的结果
[0074] 其中，泳道1-14分别对应于表4中的序号1-14,泳道15和16为空白水对照，泳道 17为标准分子量Marker, DL2000灯AKARA)。各个泳道虽然扩增出目的条带，但是非特异性 扩增的杂带多。
[00巧]图7为PCR产物酶切结果
[0076] 其中，1-6为For-MaeI+化r-120-R2引物对扩增结果，7-12为 For-MboII+For-120-R2 引物对扩增结果，13-18 为 Re-Rsa I+Re-94-Rl 引物对扩增 的结果；1，2, 7, 8, 13, 14 模板 DNA 为 1892s，3, 4, 9, 10, 15, 16 模板 DNA 为扬稻 6 号选， 5, 6, 11，12, 17, 18为F1 ;单数泳道（1，3, 5, 7, 9, 11，13, 15, 17)为PCR产物未酶切电泳结果， 双数泳道化4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18)为PCR产物酶切后电泳结果；Ml和M2为marker (标 记），分别为 DL2000 和 20bp marker。
[0077] 图8为10 % PAGE胶电泳
[0078] 图9为新设计的下游引物扩增结果
[0079] 图10为引物Re-Rsa I和Re-172R扩增的PCR产物Rsal酶切结果
[0080] 图11为不同材料dCAI^S标记酶切结果
[00引]其中，各泳道分别代表：1.孟S，2.新2s，3.广占63s，4. 1892s，5.宣69s，6.广莱s，7.Y58s，8.P88s，9.丰39s，10.安农s-l，ll.M22s，12.H980S，13.农星 58s, 14. 7001S, 15.培矮 64s, 16. YDs, 17.雁农 s, 18.，19 为空白对照，M 为 DL2000marker [0082]图12为不同材料dCAI^S标记直接PAGE胶结果
[008引其中，各泳道分别代表：1.孟S，2.新2s，3.广占63s，4.1892s，5.宣69s，6. 广莱 s, 7. Y58s, 8. P88s, 9.丰 39s, 10.安农 s-1, 11. M22s, 12. H980S, 13. c815s, 14.深 08s, 15.新安 s 16.农星 58s, 17. 7001S, 18.培矮 64s, 19. YDs, 20.雁农 s, 21. H4s, 22. W6154s，23. 8077s，24. R1128,25. R2,26.WH26,27.豪恢 808,28.R527,29.黄化占，30.盐 稻 4 号，31. y80, 32. y59, 33. y28, ：M. RH003, 35.扬稻 6 号，36.绿旱 1 号，37.培矮 64, 38. II-32B, 39.紫叶稻，40.轮回 422, 41. 02428, 42. HP121, 43.广恢 102, 44.黑壳稻，45.日本 晴，46.空白对照。
【具体实施方式】
[0084] W下叙述本发明的具体实施例。应该说明，本发明的实施例只对本发明起说明作 用，而没有任何限制作用。本领域技术人员可W对本发明作出某些等同的改动和显而易见 的改进。
[0085] l、tm巧基因的测序验证
[0086] 根据 Xu 等[Fine mapping and candidate gene analysis of ptgms2-l, the photoperiod-thermo-sensitive genic male sterile gene in rice(Oryza sativa L. )，llieor Appl Genet. 2011,122 (2): 365-372]报道的 tm巧的候选基因（L0C_ 0s02gl2290)的序列设计引物，对不育系1892s进行PCR扩增和测序分析，发现1892s和广 占63s -样，在距离tm巧起始密码子71bp处突变为A，产生终止密码子TAG。随后Zhoui 等[RNase Z^^processes UbL40 mRNAs and controls thermosensitive genic male sterility in rice,化 1:ure Communications, 2014, DOI: 10. 1038/ncomms5884]对 1892s 的 测序结果也发现1892s为tm巧突变型。本实施例中W 1892s为例进行描述，W上足W证明 了本发明所研究的水稻品种及其中的基因tm巧是得到验证的。
[0087] 2、tm巧基因功能突变位点的标记设计
[0088] 根据tm巧的功能突变位点，本申请的发明人进行针对性地引物设计。引物设计时 基于两个原则：1)设计的标记需要能切开突变型（tm巧型），而切不开野生型（Tm巧）；2)所 用的限制性内切酶较常用，易购买。但是，本申请的发明人发现，通过常规的方式，找不到能 够直接酶切PCR产物的相应的内切酶，因此，本申请的发明人给引物加上错配碱基，希望找 到合适的内切酶。发明人发现，即便添加错配碱基，也并不能保证结果的稳定。
[0089] 发明人分别错配1个碱基和2个碱基，并从正链和反链两个方向设计引物，选择较 常用的内切酶，合成的引物见表4,表4列出了 tms5基因的标记突变位点处的引物设计。
[0090]
[0091] 注：划线碱基为突变碱基。
[0092] 表 4
[009引此外，设计下游引物，扩增片段大小控制在lOObp左右，选择Tm值在60度左右，无 二聚体和错配的引物，正反项各选择了 2条引物，引物序列信息见表5,其中列出了标记下 游引物。
[0094]
[0095] 表 5
[0096] 3、