标记筛选和体系优化
[0097] 在0. 2血薄壁管中依次加入表6和7成分，进行PCR反应，表6中为普通PCR扩增 体系所采用的反应成分，表7中为引物组合对。扩增程序：95°C变性5min后，94°C 30sec， 55°C 30sec，72°C 30sec，循环35次，72°C延伸5min。4%琼脂糖凝胶电泳，拍照，结果见图 1〇
[0098]
[0101]
[010引表7
[0103]由图1知，普通PCR体系只有少数引物组合扩增出条带，1、2泳道条带很暗，如果再 用于酶切分析，很难得到清楚的结果。9和10泳道有杂带，且扩增片段的大小不正确。11 泳道较清楚，且只有一条带，扩增引物为Re-ScaI+Re-94-Rl。对PCR产物用乙醇沉淀的方法 纯化后，Sea I酶37°C过夜进行酶切，但是电泳结果显示，Seal无法切开扩增片段（图2)。 为弄清楚酶切不开的原因，我们将扩增片段进行了测序，与tm巧基因序列比对发现，扩增 片段与tm巧无同源性，说明Re-ScaI+Re-94-Rl引物对虽然扩增出较亮条带，但是脱祀了， 为假阳性结果。
[0104] 上述的结果说明，用普通PCR体系直接扩增设计的tm巧基因引物对，无法得到理 想结果。可能是tm巧功能突变位点周围有复杂的空间结构，使得PCR扩增难度大。为获得 理想的扩增结果，需要对反应体系进行优化。
[0105]我们采用 hkara 公司的 2XGC buffer I 和 2XGC buffer II 搭配 rTaq 酶，W及 5XPrime buffer和2X服GC buffer搭配Hs STAR酶，来筛选适合的扩增体系（扩增体系 见表8-10,扩增产物电泳结果见图3-6)。
[0106] 由图3知，rTaq酶搭配2XGC buffer I扩增，部分泳道出现较亮的一 条带，泳道 1(引物：For-MaeI+For-110-Rl)、泳道 2(For-MaeI+For-120-R2)、 泳道 3(For-MboII+化r-110-Rl)、泳道 4(For-MboII+化r-120-R2)和泳道 ll(Re-ScaI+Re-94-Rl)均扩出一条目标条带。泳道 7(Re-RsaI+Re-g4-Rl)和 8巧e-RsaI+Re-91-R2)虽然扩出目标条带，但是整个泳道内有杂带，其他泳道均未扩出目的 条带。对泳道1、2、3、4和11泳道片段测序分析发现，1、2、3和4泳道片段序列与tm巧基因 一致，而泳道11和普通PCR扩增的序列一样，与tm巧基因无同源性。
[0107] 由图4知，rTaq酶搭配2XGC buffer II扩增，除在泳道1、2、3、4、11与2XGC buffer I-样，能扩出单一的目的条带外，泳道7和8也能均扩出唯一的一条目的条带。测 序结果显示1、2、3、4、7、8泳道序列正确，而11泳道与图3结果一样，序列不正确。
[0108] 图5和图6分别为Hs STAR酶分别搭配5XPrime buffer和2X服GC buffer扩 增结果，由图知，Hs STAR酶在2种缓冲液环境下，每个泳道均能扩出目的条带（lOObp左 右），说明化STAR酶扩增目的位点的能力很强，但是非特异性扩增也很强，每个泳道里都 有很多杂带。
[0109] 可见，与化STAR酶相比，rTaq酶在部分引物对中能扩出单一的目的条带。2XGC buffer II和2XGC buffer I相比，2XGC buffer II能在更多的引物对中扩出单一的目 的条带。所W选用巧aq酶搭配2XGC buffer II体系扩增tm巧基因能获得更稳定可靠的 结果。
[0110] 同时，由图3-6可W看出，对于设计的引物，错配2个碱基的4条上游引物均未扩 出单一的目的条带，而错配1个碱基的3条引物在rTaq酶搭配2XGC buffer II体系中， 均扩出了单一的目的条带。而下游引物对扩增的结果无明显影响，如上游引物Re-Rsal分 别和Re-94-Rl、Re-91-Rl搭配，均能扩出目的条带。
[0111]表 8 列出了 rTaq 酶搭配 2XGC buffer I 和 2XGC buffer II 的 PCR 扩增体系。 表9列出了服STAR酶搭配2 X prime buffer的PCR扩增体系。表10列出了服STAR酶 搭配2 X GC buf f er的PCR扩增体系。
[0112]
[0117]表 10
[011引 4、引物和限制性内切酶的选择
[0119] 由于下游引物对扩增结果无明显影响，我们从4条下游引物中选择了化r-120-R2 和Re-94-Rl两条下游引物，与3条单碱基错配的上游引物搭配，组成下列引物对用于PCR 扩增（表11，其列出了引物组合和PCR产物酶切的限制性内切酶）。
[0120]
[0121]
[012引 表11
[0123] 取杂交水稻徽两优6的母本1892s、扬稻6号选和F1种子在恒溫箱中发苗，提取 DNA，用表8中的PCR扩增体系（体积增大到50yL)和表11中的引物对进行PCR扩增，PCR 产物用乙醇纯化（50 y L PCR产物中加5 y L醋酸钟和137. 5 y L无水乙醇，混匀，-80°C冰箱 放置30分钟，13000巧111离屯、15111111，200 ^170%乙醇洗涂，13000巧111离屯、10111111，烘干，加 入17. 5化超纯水溶解），用表11中对应的限制性内切酶进行酶切（肥B酶，体系aOXcut smart buffer 2化，限制性内切酶0.5化，37°C，4小时），结果如图7。
[0124] 由图7知，For-MaeI+For-120-R2引物对扩增1892s、扬稻6号选和F1DNA时，在W 扬稻6号选为模板的反应中无目的条带（泳道3)，而且PCR产物酶切不彻底，酶切后条带无 明显的位置变化（泳道2,6)，即Mae I没能切开PCR产物。For-MboII+For-120-R2引物对 扩增3个DNA，能扩出目的条带，但是Mbo II酶切后，产物全部消失（泳道8、10、12)，说明 Mbo II酶有严重的星号酶切特性，不适合作为标记使用。Re-RsaI+Re-94-Rl引物对扩增3 个DNA，也能扩出目的条带，且用Rsa I酶切后，1892s扩增条带明显变小，扬稻6号选的扩 增条带没有发生变化，而杂合体F1呈现双带，运符合共显性标记的特征，和当初的标记设 计初衷一致。但是Rsa I酶切条带在琼脂糖胶上不清楚，可能是条带太小，易弥散的原因。 因此，同样的产物，我们采用10%的PA(iE胶电泳，30分钟，结果如图8,由图8可W看出：1) 酶切后条带清晰，结果容易判读；2) tm巧型的1892s的扩增产物能被彻底酶切，而Tm巧型 的扬稻6号选却没有任何酶切痕迹；3)杂合体F1 (tms5/Tms5)呈现双亲互补带型。
[0125] 由于Re-RsaI+Re-94-Rl引物对扩增产物在琼脂糖胶上不太清楚，需用PAGE电泳， 但是，有的检测者习惯用琼脂糖检测，所W我们重新设计下游引物，W增大PCR产物大小， 拟使扩增产物在琼脂糖胶上能跑出理想结果。我们又设计了 3条下游引物（表12,其中列出 了与Re-Rsal搭配的下游引物），分别与Re-Rsal搭配，采用表8的体系进行PCR扩增，DNA 模板包括1892s、扬稻6号选和F1共3个，扩增的产物直接电泳后，结果如图9,由图9知：新 设计的引物Re-172-R3与Re-Rsal搭配可W清楚的一条目的条带（172bp)，而Re-107-R和 Re-140-R扩增的条带有较多杂带，不能使用。进一步用Rsa I酶切Re-Rsal与Re-172-R3 扩增的172bp产物，琼脂糖电泳结果显示，Rsa I酶可将1892s的扩增产物切开，而扬稻6号 选的扩增产物无法切开，F1呈现杂合双带（图10)。
[0126]
[0127]表 12
[012引 5、酶切体系的简化
[0129] 通常情况下，PCR产物在酶切之前，均经过乙醇沉淀的步骤，不仅步骤繁琐，而且消 耗时间，且由于沉淀过程有片段损失，所W要求扩增的体积大（50 iiL)。为此，我们尝试PCR 产物不纯化，直接加入Rsa I酶，且不加酶切buffer,体系为25 yL PCR产物，加入0.2 yL Rsa I酶（10U/ y L)，37°C酶切1小时和过夜酶切16小时，电泳发现，Rsa I酶均能切开含 有tm巧基因的PCR产物，且酶切条带稳定，不随酶切时间的延长而改变。因此，采用本发明 的方式进行tm巧检测，不需要可W省去PCR扩增之后的纯化过程，运是本领域技术人员无 法预料得到的。
[0130] 6、标记可行性验证
[0131] 此外，本发明用母本为1892s，父本为扬稻6号选的一个F2群体验证标记的检测 能力。2013年正季，合肥，发明人观察了 F2群体中的192株，通过观察花药饱满程度和包 颈状况，并结合花粉观察，共发现43株不育株，149可育株，提取运192个单株的DNA，采用 Re-Rsal与Re-172-R3引物进行扩增，扩增产物用Rsa I酶切，结果43株不育株的带型与 1892s -致，能被Rsal切开，对于149可育株，一部分带型与扬稻6号选一致，一部分呈双亲 的杂合带型。说明设计的dCAP标记检测与实际的育性观察结果完全一致，标记检测结果准 确可靠。
[013引 7、dCAPS-172标记对不同材料的检测
[0133] 进一步用Re-Rsal与Re-172-R3引