NA进行打断，然后再对 打断后的短片段（150bp~200bp)的mRNA进行逆转录得到双链cDNA，然后不经过扩增步骤 直接将双链cDNA进行片段化文库构建。由于这样所构建的文库通常最能真实反映所检测 样本的转录状态。而且，这种打断成小片段后再进行转录对逆转录酶的要求也相对较低，只 要能够转录较短的片段即可。
[0031] 而在本发明中，通过采用能够逆转录较长片段、逆转录活性较强且保真性较高的 MMLV逆转录酶进行mRNA的逆转录过程，并在逆转录得到双链cDNA之后进行预扩增的步骤， 以使得来源于样本mRNA的双链cDNA的量达到满足文库构建的要求，从而实现对微量样本 转录组文库的构建。
[0032] MMLV逆转录酶为莫洛尼鼠白血病毒逆转录酶，其野生型除了逆转录酶活性外，还 具有较强的RNaseH酶活性，能够对逆转录得到的RNA-DNA杂交体中的RNA链进行酶切，从 而影响逆转录片段的长度。目前可用的MMLV都是经过重组改造的逆转录酶。适用于本发 明的MMLV系列的逆转录酶包括但不仅限于SMARTScribe?逆转录酶、Superscript?IV逆转 录酶或SuperscriptsIn逆转录酶.。这些MMLV逆转录酶分别具有以下优点：高效、适于众 多RNA模板；反应抑制剂耐受性高；cDNA得率高。
[0033] 上述转录组文库构建的方法中，从总RNA中获取得到mRNA的步骤可以采用现有的 分离方法，只要能够进行后续的逆转录步骤即可，比如可以采用Oligod(T)磁珠或者Oligo (KT)引物进行捕获。在本发明中，优选采用Oligod⑴引物从待测样本的总RNA中捕获得 到mRNA，不仅能够提高mRNA的捕获效率，而且能够降低转录组文库构建的成本。在本发明 一种优选的实施例中，待测样本的总RNA小于0. 5ng。小于0. 5ng总RNA的量采用本发明的 上述构建方法同样能够实现文库的构建。
[0034] 上述构建方法中，利用MMLV逆转录酶将mRNA逆转录成双链cDNA的步骤为常规的 逆转录步骤，包括：步骤Sl，利用MMLV逆转录酶对mRNA进行逆转录，得到第一链cDNA;以及 步骤S2,以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA，得到双链cDNA。
[0035] 上述逆转录得到双链cDNA的步骤中，根据实际需要可用对得到的第一链cDNA和 双链cDNA进行纯化，以去除逆转录反应过程中的酶、dNTPs等杂质，提高后续文库构建的质 量。在本发明一种优选的实施例中，在步骤Sl和步骤S2之间，还包括对第一链cDNA进行 磁珠纯化的步骤；以及在步骤S2之后，还包括对双链cDNA进行磁珠纯化的步骤。
[0036] 上述步骤中采用磁珠纯化，方便快速且纯化效果好。市售的各种能够对DNA进行 纯化的磁珠均适用于上述纯化步骤。在本发明中，优选采用SPRIAmpureXP磁珠。
[0037] 在现有的转录组文库构建方法中，通常在文库构建之前，需要对待测样本的总RNA 的量进行检测，只要总RNA的量能够达到量的要求，就进行mRNA的捕获及打断。由于打断 后的mRNA已为短片段，因而无法检测所逆转录的双链cDNA是否涵盖发生转录了的基因的 全长。而在本发明的构建方法中所得到的双链cDNA为基因转录的全长mRNA，而基因全长 mRNA的长度通常在400bp到9000bp之间，因而可以通过安捷伦2100对双链cDNA扩增后得 到的扩增cDNA的纯度及完整性进行判断，从而对文库构建的质量进行把控。在本发明一种 优选的实例中，在对双链cDNA进行磁珠纯化的步骤后，还包括对双链cDNA的长度和浓度进 行检测的步骤。
[0038] 上述构建方法中利用扩增cDNA进行片段化文库构建得到转录组文库的步骤采用 现有的构建步骤即可。在本发明的优选实施例中，上述步骤包括：对扩增cDNA进行片段化， 得到片段化DNA;对片段化DNA进行末端修复加A，得到修复DNA;对修复DNA进行接头连接， 得到带接头DNA;对带接头DNA的片段长度进行选择，得到目的长度DNA;对目的长度DNA进 行USER酶消化，得到消化DNA;对消化DNA进行富集，得到转录组文库。
[0039] 在本发明另一种典型的实施方式中，提供了一种转录组文库，该转录组文库采用 上述任一种构建方法构建而成。该转录组文库同样能够实现特定细胞或组织在特定状态下 的基因转录状态。
[0040] 下面将结合具体的实施例来进一步说明本发明的有益效果。下列实施例参照图2 所示的详细步骤进行转录组文库的构建。
[0041] 一 ?TRizol法提取拟南芥花粉细胞的总RNA。
[0042] 1)将样本加入ImlTrizol中，震荡，室温静置5min，使其充分裂解，13000rpm离心 5min，然后将管中的上清转移至新2.OmlEP管；
[0043] 2)按照Trizol:氯仿=5:1的比例加入氯仿，盖紧管盖，漩涡振荡器上振荡混匀 15s，室温静置2-3min，使其自然分相；
[0044] 3)4°C，13000rpm离心5min，混合物会分成三层：下层红色为苯酸一氯仿有机相， 中间层和无色上层水相，RNA主要集中在水相；
[0045] 4)将上清转入一新2.OmlEP管（注意不要吸到中间层和下层），加入等体积氯仿， 漩涡振荡器上振荡混匀15s，室温静置2-3min，使其自然分相，4°C，13000rpm离心5min;
[0046] 5)将上层水相转入新的I. 5mlEP管（约500-600y1，注意不要取到下层液体）， 离心管上标明项目名称、样品名称和日期，加入等体积的异丙醇，混匀后，-80°C或干冰放置 20min；
[0047] 6) 4°C，13000rpm离心lOmin，弃掉上清；
[0048] 7)向RNA沉淀中加入Iml75%乙醇，颠倒混勾5s，4°C，13000rpm离心5min，弃上 清；
[0049] 8)重复步骤7
[0050] 9) 4°C，13000rpm离心lmin，用枪头小心吸弃多余液体；
[0051] 10)将RNA沉淀置于超净工作台吹干，约l-2min(不易太干，否则RNA很难溶解）， 用10y1无RNA酶的双蒸H2O溶解RNA沉淀。
[0052] 对溶解后的总RNA进行Qubit检测，发现检测不到样品的浓度。
[0053] 二.对提取的RNA进行扩增
[0054] (一）第一链cDNA的合成（在PCR洁净工作室）
[0055] 1.根据需要建立合适体积的反应液，以下为1个样品所需要加入的反应液的量：
[0056]
[0057] 2.RNA样品的制备
[0058] 取IyIRNA样品转移至含有2. 5yl反应缓冲液的无RNA酶的2mlPCR管中。然 后，立即将反应管放在干冰上。
[0059] 3.将样品分别放置在经-20°C预冷的PCR管架上，分别其中UP1引物（I2yM)，各 Iy1。混匀各组份，然后瞬时离心。
[0060] 其中，UPl引物SEQIDNO1 :5' -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT(30)N-1N-3'（N =A，G，G，or;N_1 = _A，G，orG)。
[0061] 4.将反应管放在PCR仪中，72°C，孵育3min，（冰浴2分钟，终止）。
[0062] 5.与此同时，在室温中混匀以下试剂：
[0063]
[0064]其中，UP2引物为SEQ ID NO 2 :5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGG-3'
[0065] 6.待孵育完成后，立即分别向这3个PCR管中加入5. 5 y 1反应混合液。用枪头轻 柔地吸打混匀，然后瞬时离心将混合物收集到管底部。
[0066]7. 42°C，孵育90min ;70°C，加热IOmin ;终止反应。
[0067](二）使用SPRI Ampure磁珠纯化第一链cDNA(建议在PCR洁净间进行实验）
[0068] 1.用200 y 1的移液管分别吸取25 y 1的SPRI Ampure XP磁珠加入到每个样品 中，定容至35 yl。用移液器吹打10次，室温下8min。
[0069] 2?瞬时离心，然后将样品管放在Promega MagnaBot II磁性分离器上，反应5min 或者更长时间，直到澄清。
[0070] 3.弃上清。瞬时离心，将液体收集到管底部。
[0071] 4.将样品管放回Promega MagnaBot II磁性分离器再放置2min或者更长时间使 磁珠