完全和液体分离开。然后，用IOy1的移液器将管中剩余的液体洗掉，确保管中不再有 剩余的上清液。
[0072] (三）LD PCR扩增双链cDNA(操作中的步骤1和2在PCR洁净间进行）
[0073] 1.准备PCR扩增反应的预混液。将下列试剂按照顺序加入管中旋涡混匀，并在微 型离心机中瞬时离心。PCR扩增反应的预混液如下：
[0074]
[0075]其中，IS PCR引物为SEQ ID NO 3 :5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT - 3'
[0076] 2.分别向样品中加入50 yl PCR预混液，混匀后瞬时离心。
[0077] 3.将各个反应管放在提前预热的PCR仪中，按照下面参数，设置PCR扩增程序：
[0078]
[0080](四）扩增后的cDNA的纯化与鉴定
[0081] 1?取出一个I. 5ml离心管，加入 90U1 的SPRIAmpureXPBeads。
[0082] 2.将全部的PCR产物包括SPRIbeads转移到含有SPRIbeads的I. 5ml离心管 中。用移液器上下吹打10次至完全混匀。室温孵育8min。
[0083] 3?将样品管中放置于磁力分离器上，大约5min，或者更长时间，直到液体完全澄 清为止。
[0084] 4.吸掉上清液，保持样品管始终在磁性分离器上，然后分别向孔中加入200y1新 配制的80%的乙醇。30s后，小心地吸掉上清液。在清洗beads上的杂质时，DNA始终是结 合在beads上。
[0085] 5?重复St印 4。
[0086] 6. 1，OOOrpm下离心IOmin将管壁的液体收集到离心管底部。
[0087] 7.将样品管放回磁力分离器，30s后，去除孔中残留的乙醇。
[0088] 8.将样品管放置在室温干燥，约3_5min后，就能看到圆颗粒表面有小裂纹。
[0089] 9.beads干后，向beads中加入12y1的纯缓冲液。将样品管从磁性分离器上取下 放在室温孵育2min，使beads再水化。
[0090] 10?吹打10次，使DNA从beads上洗脱下来。然后将样品管回磁磁力架，放置Imin 或者更长时间，直到溶液完全澄清为止。
[0091] 11.将含有纯化后的cDNA上清液转移到无核酸酶的nonsticky的管中，在每个管 子上贴上不同的标签。
[0092] 12.取Iy1进行Qubit定量。准备干净的0. 5ml离心管，写好对应样品编号，取 Iy1文库按照Qubit浓度稀释至I. 5-2ng/y1，然后采用安捷伦2100进行检测。检测结果 如图3和图4所示，样品正常扩增，在约400bp-9000bp间出现明显的峰值域，最高峰值大约 在2000bp，无污染、无降解现象。
[0093]三?NEBNext Ultra试剂盒建库：
[0094]cDNA全长Covaris打断成 150_200bp，以 20ng_400ng起始量建库；
[0095] ( -）、Covaris剪切（提前四十分钟开机）
[0096] 1.设置covaris:
[0097] a)在covaris水缸中加入去离子水，水位达到刻度左"15"；
[0098]b)检查水位是否能没过管子的玻璃部分；
[0099]c)将冷却温度设为2_5°C，冷却至5°C;
[0100] d)可选。加入乙二醇（ethyleneglycol)至总体积的20%，防止结冰。
[0101] e)按下控制板上的"Degas"按钮。使用之前Degas至少30min。
[0102] 2?在I.5mlEP管中，用IXLowTE缓冲液分别将IOng和30ngcDNA稀释到 130y1〇
[0103] 3?将CovarismicroTube装到covaris上。
[0104] 4.用维形枪头小心地吸取130yIcDNA样本，加入到CovarismicroTube管中。 (小心操作，不要使管子底部出现气泡）
[0105] 5.按照下表1设置Covaris参数，进行DNA破碎。破碎产物的主峰在150-200bp。
[0106]表 1 :
[0114] 2.轻柔混匀，瞬时离心，PCR仪上按照如下程序进行反应：
[0115] 20〇C 30min
[0116] 65°C 30min
[0117] 4°C 结束。
[0118] 3.反应结束后立刻放置冰上，立即进入下一步接头连接反应。
[0119](四）、接头的连接
[0120] (1)反应体系：
[0121]
[0122] (2)轻柔混匀，瞬时离心。20°C放置15min。
[0123] (3)在上述的产物中加入3ylUSER酶，充分混匀后，置于PCR仪中37°C反应 15min〇
[0124](五）、片段选择加接头的DNA(磁珠选择大小后再等体积去除小片段）
[0125] (1)涡旋混匀AMPure XP磁珠。
[0126] (2)准备干净的I. 5ml离心管，写好对应编号，加入16. 5yL无1^^酶氏0(使上步 反应终体积为100yL)，再加入57yL(0. 6X)重悬的AMPureXP磁珠。
[0127] (3)将Adaptor-IigatedDNA产物（83. 5U1)加入上步准备好的I.5ml离心管中， 枪头混匀，室温孵育5min。
[0128] (4)瞬时离心。置于磁力架上，静置5min。待溶液清亮后，用枪头小心吸取上清液 到另一个干净的1.5ml离心管中（上清勿弃！），12,OOOrpm离心3min后置于磁力架上。准 备干净的离心管并将对应的编号写好。将上清液转入对应的离心管中（此步磁珠上吸的为 大片段DNA，离心帮助去除磁珠，防止文库含大片段）。
[0129] (5)加入25yL(0. 25X)重悬好的AMPureXP磁珠，并用枪头混匀。室温孵育5min。
[0130] (6)磁力架上静置5min。待溶液清亮后，用枪头小心吸取丢弃上清液（注意尽量 不要吸到磁珠，此步上清含偏小的片段如接头等，磁珠上吸的为目标片段DNA)。
[0131] (7)加入200yL80%乙醇漂洗，于磁力架上静置30s。用枪头小心吸取丢弃上清液 (注意尽量不要吸到磁珠）。
[0132](8)重复步骤7-次。最后使用IOy L枪头吸取离心管底部残留的液体。
[0133](9)室温干燥X min让乙醇尽量挥发干净。
[0134](10)加入52yL无RNA酶氏0,枪头吹吸混匀，瞬时离心，置于磁力架上，静置5min。
[0135] (11)准备干净的离心管，写好对应编号，加入50 y L涡旋混匀好的AMPure XP
[0136] 磁珠。吸取上步50yL上清至对应AMPureXP磁珠管内，枪头混勾，静置5min。于 磁力架上静置5min，小心吸取丢弃上清液（注意尽量不要吸到磁珠）。
[0137] (12)加入200yL80%乙醇漂洗，于磁力架上静置30s。用枪头小心吸取丢弃上清 液（注意尽量不要吸到磁珠）。
[0138] (13)重复步骤12-次。最后使用IOii L枪头吸取离心管底部残留的液体。
[0139] (14)室温干燥Xmin让乙醇尽量挥发干净。
[0140] (15)加入22.5yL无RNA酶氏0,枪头吹吸混匀，瞬时离心，置于磁力架上，静置 5min。待溶液清亮后，用10y1枪头小心吸取21y1上清至干净的PCR管内。
[0141] (16)取I y 1进行Qubit定量。将浓度低于0. 2ng/ y 1的标注。用后的Qubit管 置于黑暗处备用。
[0142] (六）、USER酶消化和PCR富集
[0143] (1)在上述产物中加入：
[0144]
[0145] 其中，PCR引物 1 的序列为SEQIDNO4 :5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATG TGACTGGAGITCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'，PCR引物 1 为带有标签（index)序列的，其中标 签序列为上述引物中的第25位碱基至第30位碱基，即CGTGAT。
[0146] PCR引物 2 的序列为SEQIDNO5 :
[0147] 5 ' -AATGATACGGCGACCACCGAGATCT