ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3 '。
[0148] (2)轻柔混勾，加index时先在记录本中写下样品对应的index号，加时一人加，一 人check，并将人员记录。
[0149] PCR仪上进行反应：
[0150]
[0151] *注：当第八步的Qubit浓度低于0. 2ng/y1的，扩增循环增至11或12个，记录 下不同样品的扩增循环数（扩增过程中注意样品间的平行关系，一般这样的样品扩增循环 数保持一致）。
[0152] (七）、PCR产物纯化（等体积纯化两次）
[0153] (1)涡旋混匀AMPureXP磁珠。
[0154] (2)按样品数准备好干净的I. 5ml离心管，加入50yL(等体积）重悬好的AMPure XP磁珠，并将对应的编号写好。将上一步PCR产物加入准备好的XP磁珠内，并用枪头混匀。 室温孵育5min。
[0155] (3)置于磁力架上，静置5min。待溶液清亮后，用枪头小心吸取丢弃上清液（注意 尽量不要吸到磁珠）。
[0156] (4)加入200yL80%乙醇漂洗，置于磁力架上，静置30s。用枪头小心吸取丢弃上 清液（注意尽量不要吸到磁珠）。
[0157] (5)重复步骤4 一次。最后使用IOyL枪头吸取离心管底部残留的液体。
[0158] (6)敞开盖子Xmin让乙醇尽量挥发干净，至磁珠干燥。
[0159] (7)加入52yL无RNA酶H2O,涡旋混勾，瞬时离心，置于磁力架上，静置5min。
[0160] (8)准备干净的离心管，写好对应编号，加入50yL涡旋混匀好的AMPureXP磁珠。 吸取上步50yL上清至对应AMPureXP磁珠管内，枪头混匀，静置5min。置于磁力架上，静 置5min。于磁力架上小心吸取丢弃上清液（注意尽量不要吸到磁珠）。
[0161] (9)加入200yL80%乙醇漂洗，于磁力架上静置30s。用枪头小心吸取丢弃上清 液。
[0162] (10)重复步骤9一次。最后使用IOii L枪头吸取离心管底部残留的液体。
[0163] (11)室温干燥Xmin让乙醇尽量挥发干净。
[0164] (12)加入22.5yL无RNA酶氏0,枪头吹吸混匀，瞬时离心，置于磁力架上，静置 5min。待溶液清亮后，用10yL枪头枪头小心吸取21y1上清至干净的离心管内；当第八步 的Qubit浓度低于0. 2ng/y1的，最后文库溶于12y1无RNA酶H2O中，吸出10y1上清至 干净的离心管内。
[0165] (13)取Iy1进行Qubit定量。记下文库浓度，写上文库编号。准备干净的0. 5ml 离心管，写好对应文库编号，取Iy1文库按照Qubit浓度稀释至I. 5-2ng/y1，交至上机组 做库检。
[0166] 将检测合格样品取IOOng用NEBNextUltra试剂盒建库，库检合格后上机测序。
[0167] 对测序后的数据进行处理，并对测序数据的有效量和测序质量进行了检测，检测 结果见表2。
[0168]表2:
[0169]
[0170] 从表2中可以看出，利用本发明的转录组文库构建方法，不仅实现了微量样本的 转录组文库的构建，而且取得了所构建得到文库测序后所得的数据的有效量高达73. 27~ 78. 84%，碱基的测序错误率低至0. 03 %~0. 05 %的预料不到的技术效果。
[0171] 从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本发明 的上述构建方法利用Trizol方法对微量细胞提取RNA，用莫洛尼鼠白血病毒逆转录酶 (MMLVRT)将提取的总RNA样品中的mRNA进行反转录，在cDNA的两端加上锚定序列，然后利 用锚定序列进行PCR扩增，安捷伦2100对扩增产物进行检测，判断样品是否存在污染或降 解情况，完成质控检测。将检测合格样品用于后续建库，实现了微量细胞转录组测序文库构 建。该方法具有良好的再现性、准确性。
[0172] 本发明的上述构建方法实现了微量细胞转录组文库的构建，具有以下优点：
[0173] 1.可以很好的处理低起始量的细胞样品，为微量细胞转录组文库构建提供了一个 简单有效的解决方案。
[0174] 2.通过此方法扩增后对样品进行质控，快速准确，同时具有高通量的能力。
[0175] 3.本方法还适用于微量降解或污染的样品。微量污染或降解如果对后续的信息分 析影响不大，需要建库，该方法也可以完成此类样品建库。
[0176] 以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人 员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、 等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0177]
【主权项】
1. 一种转录组文库的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括： W待测样本的总RNA为模板，利用MMLV逆转录酶进行逆转录，得到总RNA中的mRNA的 双链cDNA; 对所述双链cDNA进行扩增，得到扩增cDNA;W及 利用所述扩增cDNA进行片段化文库构建，得到所述转录组文库。2. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，利用01igodT引物和所述MMLV逆转 录酶将所述待测样本的总RNA中的所述mRNA逆转录成所述双链cDNA。3. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述待测样本的所述总RNA的量小于 5ng。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述MMLV逆转录酶为 重组MMLV逆转录酶，所述重组MMLV逆转录酶为SMARTScribe?逆转录酶、.細賊沒域够潜IV逆 转录酶或SuperStrfft#III逆转录酶。5. 根据权利要求1至3中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述W待测样本的总 RNA为模板，利用MMLV逆转录酶进行逆转录，得到总RNA中的mRNA的双链cDNA的步骤包 括： 步骤S1，利用MMLV逆转录酶对所述总RNA中的所述mRNA进行逆转录，得到第一链cDNA;W及 步骤S2,W所述第一链cDNA为模板合成第二链cDNA，得到所述双链cDNA。6. 根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于， 在所述步骤S1和步骤S2之间，还包括对所述第一链cDNA进行磁珠纯化的步骤；W及 在所述步骤S2之后，还包括对所述双链cDNA进行磁珠纯化的步骤。7. 根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述磁珠纯化步骤中，所述磁珠为 SPRIAmpureXP磁珠。8. 根据权利要求6或7所述的构建方法，其特征在于，在对所述双链cDNA进行磁珠纯 化的步骤后，还包括对所述双链cDNA的长度和浓度进行检测的步骤。9. 根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述利用扩增cDNA进行片段化文库 构建，得到所述转录组文库的步骤包括： 对所述扩增cDNA进行片段化，得到片段化DNA; 对所述片段化DNA进行末端修复加A，得到修复DNA; 对所述修复DNA进行接头连接，得到含有带接头DNA和不带接头DNA的混合物； 对所述混合物中的带接头DNA进行分离，得到带接头的DNA; 对所述带接头的DNA进行US邸酶消化，得到消化DNA;W及 对所述消化DNA进行富集，得到所述转录组文库。10. -种转录组文库，其特征在于，所述转录组文库采用权利要求1至9中任一项所述 的构建方法构建而成。
【专利摘要】本发明提供了一种转录组文库及其构建方法。该构建方法包括：以待测样本的总RNA为模板，利用MMLV逆转录酶进行逆转录，得到总RNA中的mRNA的双链cDNA；对双链cDNA进行扩增，得到扩增cDNA；利用扩增cDNA进行片段化文库构建，得到转录组文库。通过利用MMLV逆转录酶将总RNA中的mRNA逆转录成全长片段的双链cDNA；再对双链cDNA进行扩增，以达到文库构建所需要的DNA的量，进而能够顺利实现后续片段化文库的构建。该方法不仅能够富集完整全长的转录本，而且能够高敏感度、无偏好性地扩增cDNA，因而还可以维持原始mRNA各转录本的丰度，从而能够实现微量样本转录组文库的构建。
【IPC分类】C40B40/06, C40B50/06
【公开号】CN105002569
【申请号】CN201510417274
【发明人】王大伟, 李宗文, 蒋智, 朱海浩, 李富威, 刘运超, 李明洲
【申请人】北京诺禾致源生物信息科技有限公司
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年7月15日