C9K-XynA3o
[0041]将突变体表达质粒用Sal I进行线性化，表达质粒线性化片段通过电穿孔法转化毕赤酵母GS115，在MD平板上分别筛选得到毕赤酵母重组菌株GS115/pPIC9K-XynAl、GS115/pPIC9K-XynA2和GS115/pPIC9K_XynA3，然后分别在含不同浓度遗传霉素的YPD平板上筛选多拷贝的转化子。
[0042]将筛选得到的重组表达木聚糖酶突变体XynAl、XynA2、XynA3的阳性转化子分别命名为毕赤酵母 XynAl (Pichia pastoris XynAl)、毕赤酵母 XynA2 (Pichia pastorisXynA2)和毕赤酵母XynA3 (Pichia pastoris XynA3)，然后分别转接于BMGY培养基中，30°C、250rpm振荡培养Id ;再转入BMMY培养基中，30°C、250rpm振荡培养；每天添加0.5%的甲醇，诱导表达4d ;离心去除菌体，分别得到含木聚糖酶突变体XynAl、XynA2和XynA3的发酵上清液；将其进行SDS-PAGE电泳检测分析，结果显示上述发酵上清液中木聚糖酶突变体的分子量大小约为20kDa。
[0043]通过上述同样的酶切连接方法将野生型木聚糖酶基因XynPF克隆到毕赤酵母GS115宿主中，构建得到重组表达野生型木聚糖酶XynPF的毕赤酵母工程菌，命名为毕赤酵母 XynPF (Pichia pastoris XynPF)。摇瓶水平发酵毕赤酵母 XynPF，30°C、250rpm 振荡培养；每天添加0.5%的甲醇，诱导表达4d ;离心去除菌体，得到含野生型木聚糖酶XynPF的发酵上清液。
[0044](I)木聚糖酶活单位的定义
[0045]在37°C、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的木聚糖溶液中释放Iymol还原糖所需要的酶量即为一个酶活力单位U。
[0046](2)酶活测定方法
[0047]取2ml浓度为I %的木聚糖底物(pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液配制)，加入到比色管中，37°C平衡lOmin，再加入2ml经pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液适当稀释并经37°C平衡好的酸性木聚糖酶酶液，混匀于37°C精确保温反应30min。反应结束后，加入5ml DNS试剂，混匀以终止反应。然后沸水浴煮沸5min，用自来水冷却至室温，加蒸馏水定容至25ml，混匀后，以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光值Ae。
[0048]酶活计算公式:
[0049]Xd= [(Ae-Ab) XK+C0] XNX 1000/(MX t)
[0050]式中:XD为稀释酶液中木聚糖酶的活力，U/ml 'k E为酶反应液的吸光度；A B为酶空白液的吸光度；κ为标准曲线的斜率；C。为标准曲线的截距；M为木糖的摩尔质量，150.2g/mo I ；t为酶解反应时间，min ；N为酶液稀释倍数；1000为转化因子，Immol = 1000 μπιο?。
[0051](3)酶活测定结果
[0052]按照上述方法分别检测上述毕赤酵母XynPF、毕赤酵母XynAl、毕赤酵母XynA2和毕赤酵母XynA3发酵上清液中木聚糖酶酶活。结果显示:毕赤酵母XynPF发酵上清液的酶活为245U/ml，而毕赤酵母XynAl、毕赤酵母XynA2和毕赤酵母XynA3发酵上清液的酶活分别为 260U/mL，271U/mL 和 254U/mL。
[0053]实施例4发酵验证
[0054]在10升发酵罐上分别进行毕赤酵母XynPF、毕赤酵母XynAl、毕赤酵母XynA2和毕赤酵母XynA3的发酵，发酵使用的培养基配方为:硫酸钙1.lg/L、磷酸二氢钾5.5g/L、磷酸二氢铵55g/L、硫酸钾20.3g/L、硫酸镁16.4g/L、氢氧化钾1.65g/L、消泡剂0.05%。
[0055]发酵生产工艺:pH值5.0、温度30°C、搅拌速率300rpm、通风量1.0?1.5(v/v)、溶氧控制在20%以上。
[0056]整个发酵过程分为三个阶段:第一阶段为菌体培养阶段，按7%比例接入种子，30°C培养24?26h，以补完葡萄糖为标志；第二阶段为饥饿阶段，当葡萄糖补完之后，不流加任何碳源，当溶氧上升至80%以上表明该阶段结束，为期约30?60min ;第三阶段为诱导表达阶段，流加甲醇诱导，并且保持溶氧在20%以上，培养时间在150?ISOh之间。发酵结束后，发酵液通过板框过滤机处理后获得粗酶液。
[0057]采用实施例3所述木聚糖酶酶活测定方法对上述粗酶液进行检测，结果显示，重组表达野生型木聚糖酶的毕赤酵母XynPF最终的发酵酶活为7650U/ml，而重组表达木聚糖酶突变体的毕赤酵母XynAl、毕赤酵母XynA2和毕赤酵母XynA3最终的发酵酶活分别为801lU/ml，9340U/ml，7389U/ml。
[0058]实施例5木聚糖酶的酶学性质测定
[0059]1、最适作用pH分析
[0060]采用pH 值分别为 2.0,2.5,3.0,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,7.0,8.0 的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，将实施例4发酵获得的粗酶液进行稀释测定，木聚糖底物也分别用对应PH值的缓冲液配制，在37°C下进行木聚糖酶活力测定，计算酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，结果显示，本发明提供的木聚糖酶突变体XynAl、XynA2和XynA3的最适作用pH值均为5.5，与野生型木聚糖酶XynPF —致。
[0061]2、最适反应温度分析
[0062]分别在30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C，ρΗ5.5 条件下，对实施例4发酵获得的粗酶液进行木聚糖酶酶活测定，以最高酶活为100%，计算相对酶活，结果显示，野生型木聚糖酶XynPF的最适作用温度为50°C ;而本发明提供的木聚糖酶突变体XynAl、XynA2和XynA3的最适作用温度为60°C。
[0063]3、耐热性分析
[0064]将实施例4发酵获得的粗酶液分别用pH5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液稀释至约20U/ml，在65°C、75°C和80°C条件下分别处理5min后，测定其残留酶活，以未处理样品的酶活为100%，计算酶活残留率。
[0065]结果如图1所示，野生型木聚糖酶XynPF在65°C条件下处理5min后，仅能保持28%左右的酶活，在75°C、80°C条件下处理5min后，酶活残留率几乎为O ;而木聚糖酶突变体XynAl在65°C条件下处理5min后能保持45 %以上的酶活，在75°C、80°C条件下处理5min后仍能保持30%和21 %左右的酶活，木聚糖酶突变体XynA2和XynA3在65°C条件下处理5min后能保持80%以上的酶活，在75°C条件下处理5min后仍能保持40%左右的酶活，80°C条件下处理5min后仍能保持30%左右的酶活。上述结果表明，与野生型相比，本发明提供的木聚糖酶突变体的耐热性得到显著提高。
[0066]综上所述，本发明提供的木聚糖酶突变体XynAl、XynA2和XynA3的最适作用温度为60°C，且比野生型木聚糖酶具有更强的耐热性，因此更适合广泛应用于饲料加工领域，前景广阔。
[0067]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种木聚糖酶突变体，其特征在于，所述的木聚糖酶突变体的氨基酸序列为SEQ IDNO:3。2.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的木聚糖酶突变体。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQID Ν0:4。4.一种木聚糖酶突变体，其特征在于，所述的木聚糖酶突变体是权利要求1所述的木聚糖酶突变体的第130位氨基酸由Thr突变为Pro。5.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求4所述的木聚糖酶突变体。6.一种木聚糖酶突变体，其特征在于，所述的木聚糖酶突变体是权利要求4所述的木聚糖酶突变体的第80位氨基酸由Thr突变为Arg，第115位氨基酸由Asp突变为Glu。7.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求6所述的木聚糖酶突变体。8.—种重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒用于在宿主细胞内表达权利要求1、4或6所述的木聚糖酶突变体。9.一种重组宿主细胞，其特征在于，所述的重组宿主细胞为携带有权利要求8所述的重组质粒的宿主细胞。10.如权利要求9所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为毕赤酵母。
【专利摘要】本发明的目的是提供一种耐高温木聚糖酶突变体。所述木聚糖酶突变体的最适作用pH值均为5.5，与野生型木聚糖酶XynPF一致，但最适作用温度为60℃，且比野生型木聚糖酶具有更强的耐热性。其中，木聚糖酶突变体XynA1在65℃条件下处理5？min后能保持45%以上的酶活，在75℃、80℃条件下处理5？min后仍能保持30%和21%左右的酶活，木聚糖酶突变体XynA2和XynA3在65℃条件下处理5？min后能保持80%以上的酶活，在75℃条件下处理5？min后仍能保持40%左右的酶活，80℃条件下处理5？min后仍能保持30%左右的酶活。所述木聚糖酶突变体可广泛应用于饲料领域，前景广阔。
【IPC分类】C12R1/84, C12N1/19, C12N15/56, A23K1/165, C12N15/81, C12N9/42
【公开号】CN105039289
【申请号】CN201510579487
【发明人】吴秀秀, 邵弨
【申请人】青岛蔚蓝生物集团有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年9月11日