种 密度为IXIO5个/孔。每孔加入2. 5ml含lOOU/mL青霉素和lOOU/mL链霉素，体积分数为 55%LONZA人干细胞无血清培养基（LonzaUltra⑶LTURE?) ,45%角朊细胞无血清培养基 (Keratinocyteserum-freemedium,KFSM)的培养液，25ng/ml表皮生长因子（EGF)，25ug/ ml胰岛素的完全培养液。
[0109] 每隔2-3天更换新的培养液。培养7天后取出细胞爬片。
[0110] 倒置显微镜下观察：培养7d后，细胞生长缓慢，可见少许集落；培养至第14d，细胞 体积有见增大。
[0111] 扫描电镜观察：继续培养7天后可见细胞粘附于支架上，与支架包裹在一起；将其 放大至2000倍，可见明显的细胞，其"伪足"牢牢抓住支架间隙。
[0112] 按照免疫组化染色SP法试剂盒的说明书进行细胞角蛋白AEl和AE5的免疫组化 染色，DAB显色。AEl免疫组化染色结果表明，可见少许AEl抗体DAB着色细胞，呈散在分 布，而且细胞着色较淡。AE5抗体淡着色。
[0113] 实施例8
[0114] 在transwell小室的下室中制备白芨多糖凝胶。方法如实施例3。将0. 5mL多糖 溶液加入六孔板，加入等体积的交联剂，室温静置30s。
[0115] 取增殖对数期的第3-5代hUC-MSCs和第2代羊膜上皮细胞，接种于Transwell共 培养体系中，上室植入羊膜上皮细胞接种密度为4XIO5个/孔，下室植入hUC-MSCs，接种密 度为I. 5XIO5个/孔。每孔加入2. 5ml含lOOU/mL青霉素和lOOU/mL链霉素，体积分数为 55%LONZA人干细胞无血清培养基（LonzaUltra⑶LTURE?) ,45%角朊细胞无血清培养基 (Keratinocyteserum-freemedium,KFSM)的培养液，5ng/ml表皮生长因子（EGF)，5ug/ml 胰岛素的完全培养液。
[0116] 每隔2-3天更换新的培养液。培养7天后取出细胞爬片。
[0117] 倒置显微镜下观察：培养7d后，细胞生长缓慢，可见少许集落；培养至第14d，细胞 体积有见增大。
[0118] 扫描电镜观察：继续培养7天后可见少量细胞粘附于支架上，与支架包裹在一起； 将其放大至2000倍，可见明显的细胞，其"伪足"牢牢抓住支架间隙。
[0119] 按照免疫组化染色SP法试剂盒的说明书进行细胞角蛋白AEl和AE5的免疫组化 染色，DAB显色。免疫组化染色结果表明，可见少许AEl抗体DAB着色细胞。呈散在分布， 而且细胞着色较淡。AE5抗体淡着色。
[0120] 对比例1
[0121] 取增殖对数期的第3-5代hUC-MSCs和第2代羊膜上皮细胞，接种于Transwell共 培养体系中，上室植入羊膜上皮细胞接种密度为4XIO5个/孔，下室植入hUC-MSCs，接种密 度为IXIO5个/孔。
[0122] 培养板上不添加任何凝胶，每孔加入2. 5ml含lOOU/mL青霉素和lOOU/mL链霉素， 体积分数为55 %LONZA人干细胞无血清培养基（LonzaUltra⑶LTURE?) ,45%角朊细胞无 血清培养基（Keratinocyteserum-freemedium,KFSM)的培养液，10ng/ml表皮生长因子 (EGF)，lOug/ml胰岛素的完全培养液。
[0123] 每隔2-3天更换新的培养液。培养7天后取出细胞爬片。
[0124] 倒置显微镜下观察：培养7d后，细胞则呈梭形，单层融合生长。继续培养至14d， 可见细胞体积有见增大。
[0125]按照免疫组化染色SP法试剂盒的说明书进行细胞角蛋白AEl和AE5及P63的免 疫组化染色，DAB显色。免疫组化染色结果表明，可见少许DAB着色细胞。呈散在分布而且 细胞着色较浅。
[0126] 实施例9
[0127] 对实施例6~8及对比例1所得细胞经免疫组化检测后，对AEl、AE5染色的细胞 进行计数，计算出两组的分化率进行比较。每组取样3次，分别检测后统计数据。
[0128] 诱导分化率=染色阳性细胞数/细胞总数X100%。
[0129] 统计结果如表2:
[0130] 表2各组细胞分化率
[0131]
[0132] 注：同列肩标不同字母表示具有显著性差异（p〈0. 01)
[0133] 实验表明，将脐带间充质干细胞和羊膜上皮细胞共培养，7天后脐带间充质干细 胞部分呈分化趋势，细胞呈散在分布，经检测，hUC-MSCs分化为角膜上皮细胞的分化率可 达31. 96%。而没有采用凝胶支架的对比例中hUC-MSCs的分化率为26. 52% ;可见，本发 明提供的方法能够提高hUC-MSCs向角膜上皮细胞分化的百分率，该效果具有显著性差异 (p〈0. 01)。
[0134] 以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为 本发明的保护范围。
【主权项】
1. 白芨多糖水凝胶的制备方法，其特征在于，由白芨多糖经硫酸化后以e-聚赖氨酸 交联制得白芨多糖水凝胶。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述白芨多糖的制备方法为：将白 芨粉碎后经水提醇沉，所得沉淀以水重悬，以氯仿和丁醇的混合物抽提后，经30000D~ 50000D透析，干燥制得白芨多糖。3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述硫酸化的试剂为氯磺酸与吡啶 的混合物。4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述交联的温度为18°C~35°C，时间 为 20s ~40s。5. 权利要求1~4任一项所述制备方法制得的白芨多糖水凝胶。6. 权利要求1~4任一项所述制备方法制得的白芨多糖水凝胶在细胞培养或诱导分化 中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述诱导分化为诱导脐带间充质干细胞 向角膜上皮细胞分化。8. 诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的方法，其特征在于，以权利要求1~ 4任一项所述制备方法制得的白芨多糖水凝胶为支架，在培养液存在条件下，将脐带间充质 干细胞与羊膜上皮细胞共培养；所述培养液包括基础培养基、表皮生长因子和胰岛素。9. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述表皮生长因子与胰岛素的质量比为 (5 ~25) : (5000 ~25000)。10. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述脐带间充质干细胞与羊膜上皮细胞 的个数比为（1~1. 5) : (4~6)。
【专利摘要】本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及白芨多糖水凝胶、培养基质及其应用与诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的方法。本发明将白芨多糖经硫酸化后与携带多官能团的ε-聚赖氨酸交联制得多糖水凝胶。该白芨多糖水凝胶呈半透明膜状，其中具有良好的孔隙，适宜细胞的生长与分化。实验表明，以本发明提供的白芨多糖水凝胶为支架，将hUC-MSCs与羊膜上皮细胞共培养7天后，hUC-MSCs的分化率可达31.96％。该分化率显著(p<0.01)未采用凝胶支架的对比例。并且，本发明提供的凝胶还能够使细胞生长旺盛，缩短诱导时间。
【IPC分类】C08L5/00, C08J3/075, C12N5/071, C08L77/02, C08B37/00, C08J3/24
【公开号】CN105085938
【申请号】CN201510540753
【发明人】王一飞, 陈海佳, 葛啸虎, 戚康艺
【申请人】广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年8月28日