外泌体提取试剂盒及其在肿瘤等疾病液体活检中的应用_3
的含有RNA 的无DNase/Rnase水反复冲洗1-2次，离心机最大转速1分钟，以得到较高纯度的RNA。经 检测，从外泌体重悬液中提取的总RNA，约100-150ng/ul，共计20-25ul。为保证实验的顺利 进行，所得量可进行后续实验约10次，故而实验具有可重复性，可以确保实验的准确性。
[0076] 实施步骤6反转录合成cDNA
[0077] 使用Invitrogen公司的SuperscriptIIIReverseTranscriptase试剂盒，以总 RNA为模板，反转录合成cDNA，反应步骤如下：
[0078] 根据各自RNA浓度计算统一的RNA含量（20uL)体系。Invitrigen试剂盒反转录 体系（20uL):照下述比例配成IOuL体系加入PCR管中：
[0079]
[0080] 提前设置水浴锅到65°C，将上述IOuL体系的PCR管置于水浴锅中5分钟，后冰浴 至少1分钟，完成上述步骤后，加入如下IOuL体系：
[0081]
[0082] 配成20uL体系，体系混匀后，将按照上述方式配置的20uL体系的PCR管置于 BIO-RADS1000温度循环变温器（聚合酶链式反应仪）按如下设定步骤进行
[0083]
[0084] 反应完成后将反应所得的cDNA放置4°C冰箱保存即可
[0085] 实施步骤7采用引物G0LM1-MAK10上游引物
[0086] 5' -CAGGGAATGACAGAAACA-3' 以及G0LM1-MAK10 下游弓I物 5'-TCTTCGGCAGAGTAGTTG-3'，按以下条件进行RealTimePCR反应。按照下述比例配成25uL RealTimePCR反应体系（InvitrigenwithR0X)加入PCR管中：
[0087]
[0088] 将按照上述方式配置的25uL体系的PCR管置于ABI7300中按如下设定步骤进行： Real Time PCR反应条件为
[0089]
[0090] 使用 Applied Biosystems 7500Real Time PCR System进行实时焚光定量PCR检 测，其中从步骤2到步骤4持续40个循环。
[0091] 图4示出食管癌、良性食管疾病外周血血清中G0LM1-MAK10的表达量：食管癌患 者较良性食管疾病外周血中运用外泌体所得G0LM1-MAK10的表达量明显要高，且P值有统 计学意义。图中**示P值〈〇. 01。图5示出G0LM1-MAK10对诊断食管癌的特异性以及敏感 性。
[0092] 实验二、通过检测唾液中外泌体中的融合RNA G0LM1-MAK10的RNA含量，对于食管 癌患者进行诊断。
[0093] 采用滴取法收集受试者非刺激性全唾液。唾液收集在早晨、空腹、安静房间里进 行。嘱咐受试者用清水30ml漱口以清除口腔内残渣，吐尽残留液体，5分钟后使唾液自然流 出。收集其非刺激性全唾液于无菌平板培养皿中，而后迅速分装至无菌I. 5mlEP管中，立 即置-70°C保存待用。以该方法采集食管癌患者30例，同期采集正常人或食管良性病变10 例。
[0094] 取食管鳞癌患者唾液样本约300ul，3000g/分钟离心15分钟，取上清加入适量的 ExoQuick外泌体提取溶液，应注意需4°C过夜或稍延长放置时间后，根据实施案例一中所 示的步骤将唾液标本中外泌体提取出来，在使用ExoQuick外泌体提取溶液时，应注意吸除 上清后，可继续12000转/分空转5分钟后，使沉淀尽可能的析出。
[0095] 运用NanoSight分析外泌体成分含量（如图6所示），即每300ul唾液可获得约 20-25uL的外泌体，颗粒数约为6X10 8,在使用Direct-zol?RNA MiniPr印kit从外泌体中提 取RNA时，应注意最后运用无DNase/RNase-Free水冲洗时，可利用冲洗后的所得液体再次 冲洗2-3次，以得到更高浓度及纯度的RNA，浓度约100-150ug/ul，反转录成cDNA，然后运用 上述所提到的食管癌特异性诊断标志物G0LM1-MAK10,利用RT-PCR进行检测或通过PCR扩 增并使用DNA电泳，使用凝胶成像系统将电泳后的胶拍摄成图像，然后进行分析。如图7所 示，食管癌患者较良性食管疾病唾液中运用外泌体所得G0LM1-MAK10的表达量明显要高， 且P值有统计学意义。图中**示P值〈0.01。
[0096] 实验三、通过检测唾液中的PTPRO的RNA含量，对于食管癌患者进行分层。
[0097] 采用滴取法收集受试者非刺激性全唾液。唾液收集在早晨、空腹、安静房间里进 行。嘱咐受试者用清水30ml漱口以清除口腔内残渣，吐尽残留液体，5分钟后使唾液自然流 出。收集其非刺激性全唾液于无菌平板培养皿中，而后迅速分装至无菌I. 5mlEP管中，立 即置-70°C保存待用。以该方法采集食管癌患者30例。
[0098] 取食管鳞癌患者唾液样本约300ul，3000g/分钟离心15分钟，取上清加入适量的 ExoQuick外泌体提取溶液，应注意需4°C过夜或稍延长放置时间，根据实施案例一中所示 的步骤将唾液标本中外泌体提取出来，在使用ExoQuick外泌体提取溶液时，应注意吸除上 清液后，可继续12000转/分空转5分钟后，使沉淀尽可能的析出。运用NanoSight分析 外泌体成分含量。即每300ul唾液可获得约20-25uL的外泌体，颗粒数约为4-10X108,在 使用Direct_zol?RNAMiniPrepkit从外泌体中提取RNA时，应注意最后运用无DNase/ RNase-Free水冲洗时，可利用冲洗后的所得液体再次冲洗2-3次，以得到更高浓度及纯 度的RNA，浓度约100-150ug/ul，反转录成cDNA，然后运用食管癌患者特异性分层标志物 PTPRO引物进行RT-PCR检测或通过PCR扩增并使用DNA电泳，使用凝胶成像系统将电泳后 的胶拍摄成图像，然后进行分析。
[0099] 图8示出了两例放化疗敏感患者与两例放化疗抵抗患者的PTPRO的PCR结果。通 过总的数据分析得出，PTPRO高表达的食管癌患者较PTPRO低表达食管癌患者对放化疗的 敏感性更好。
[0100] 实验四、通过提取乳腺癌外周血中外泌体的PTPRO的RNA，对乳腺癌进行诊疗。
[0101] 实施步骤1临床标本收集
[0102] 采集对象：100例乳腺癌患者手术前外周血及手术后外周血均来自医院的临床病 例资料完整的患者，均为女性，平均年龄（47±9)岁。其中，早期乳腺癌病人40例，晚期乳 腺癌病人60例，所有患者术前均未接受放疗或化疗。同期采集30例正常人的外周血作为 对照组。
[0103] 具体方法如下：分别抽取乳腺癌患者及乳腺良性病变或正常患者抗凝外周血2毫 升，使用eppendorfCentrifuge5417R低温台式离心机，2500转/分钟，离心15分钟，收集 上层血清，_80°C保存，做好登记。
[0104] 实施步骤2外泌体提取制备
[0105] 取乳腺癌、良性乳腺疾病患者以及正常人外周血约250ul，3000g/分钟离心 15min。用移液器将离心所得上清液移至新的离心管，直接加入适量的ExoQuick外泌体沉 淀溶液混匀，室温孵育30分钟或4°C混匀2-3小时后静置过夜，其中的ExoQuick外泌体沉 淀溶液与外周血比例如下：
[0106]
[0107] 将孵育完后的离心管放入离心机中，1500g/分钟离心30分钟后，可以看到外泌体 在离心管底部形成白色沉淀。用移液器小心吸除上清，并将含有剩余ExoQuick溶液的离心 管再次离心，1500g/分钟离心5分钟。小心移除离心管内所有的液体，注意不要碰到外泌 体白色沉淀物。应注意可继续1500g/分钟空转5分钟，使沉淀尽可能析出。将外泌体白色 沉淀物用适量IXPBS重悬得到外泌体重悬液，或用300ulTRizol溶液，-70°C保存。即每 300uL的外周血可获得约20-25uL的外泌体，颗粒数约为6X1011，可用以电镜以及免疫印迹 法确认所提取白色沉淀物是否为所需外泌体，或者进行下一步总RNA提取实验。
[0108] 实施步骤3电镜下确认外泌体
[0109] 将上述所得到的外泌体重悬液取2-3ul稀释10倍后滴20-30ul的于载样铜网上， 室温下静置1分钟，用滤纸从侧面吸干液体，直接滴加20mL/L磷钨酸溶液（pH6. 8)约30yL 于铜网上，室温下负染1分钟.滤纸吸干负染液，白炽灯下烤干约10分钟，透射电镜下观察 照相。（外泌体大小为40~IOOnm)。
[0110] 实施步骤4免疫印迹确认外泌体
[0111] 将上述所得到的外泌体重悬液取适量加入300ul~400ul含有蛋白酶抑制剂 的RIPA裂解液，置于冰上晃动30分钟，再以12000g/分钟离心15分钟，收集上清液，可 于-80°C保存待用（ReagentA)。将收集的待测蛋白样品用IXPBS稀释12倍，漩涡混 匀；将标准品（常用0.025、0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.5及21^/^1)和待测样品分别 吸取20yL加入到96孔板中，并设置空白对照。将待测蛋白样品加入96孔板中，每孔 20uL(ReagentB)，每个样品设置三个重复；将蛋白质定量试剂ReagentA与ReagentB 按50:1的比例混和均匀，现用现配，避光保存。将配好的混和液加入到96孔板中，每孔 160yL;37°C培养箱孵育30分钟后，遮挡摇勾，并冷却至室温，用酶标仪测量0D570,并根据 标准曲线换算样品蛋白浓度。
[0112] 准备蛋白样品，20ug/孔计算，加上样缓冲液5*loading，105°C煮5分钟，蛋白变 性，形成SDS-蛋白复合物，带负电。配制15%分离胶，混匀后，把分离胶加入板中，用Iml的 水压线，室温放置40分钟~1小时。弃除水，且用吸水纸吸干，配制5%浓缩胶2mL，灌胶， 插梳。加入电泳缓冲液Tris-Glybuffer，液面过加样孔，外部液面过电极或扣板。注意是 否出现漏液。点样后，60V，30分钟浓缩蛋白，蛋白压成一条线；当蛋白进入分离胶后，100V， I. 5h；
[0113] 剪取与胶合适大小的NC膜，使用前双蒸水浸泡5分钟，转入4
[0076] 实施步骤6反转录合成cDNA
[0077] 使用Invitrogen公司的SuperscriptIIIReverseTranscriptase试剂盒，以总 RNA为模板，反转录合成cDNA，反应步骤如下：
[0078] 根据各自RNA浓度计算统一的RNA含量（20uL)体系。Invitrigen试剂盒反转录 体系（20uL):照下述比例配成IOuL体系加入PCR管中：
[0079]
[0080] 提前设置水浴锅到65°C，将上述IOuL体系的PCR管置于水浴锅中5分钟，后冰浴 至少1分钟，完成上述步骤后，加入如下IOuL体系：
[0081]
[0082] 配成20uL体系，体系混匀后，将按照上述方式配置的20uL体系的PCR管置于 BIO-RADS1000温度循环变温器（聚合酶链式反应仪）按如下设定步骤进行
[0083]
[0084] 反应完成后将反应所得的cDNA放置4°C冰箱保存即可
[0085] 实施步骤7采用引物G0LM1-MAK10上游引物
[0086] 5' -CAGGGAATGACAGAAACA-3' 以及G0LM1-MAK10 下游弓I物 5'-TCTTCGGCAGAGTAGTTG-3'，按以下条件进行RealTimePCR反应。按照下述比例配成25uL RealTimePCR反应体系（InvitrigenwithR0X)加入PCR管中：
[0087]
[0088] 将按照上述方式配置的25uL体系的PCR管置于ABI7300中按如下设定步骤进行： Real Time PCR反应条件为
[0089]
[0090] 使用 Applied Biosystems 7500Real Time PCR System进行实时焚光定量PCR检 测，其中从步骤2到步骤4持续40个循环。
[0091] 图4示出食管癌、良性食管疾病外周血血清中G0LM1-MAK10的表达量：食管癌患 者较良性食管疾病外周血中运用外泌体所得G0LM1-MAK10的表达量明显要高，且P值有统 计学意义。图中**示P值〈〇. 01。图5示出G0LM1-MAK10对诊断食管癌的特异性以及敏感 性。
[0092] 实验二、通过检测唾液中外泌体中的融合RNA G0LM1-MAK10的RNA含量，对于食管 癌患者进行诊断。
[0093] 采用滴取法收集受试者非刺激性全唾液。唾液收集在早晨、空腹、安静房间里进 行。嘱咐受试者用清水30ml漱口以清除口腔内残渣，吐尽残留液体，5分钟后使唾液自然流 出。收集其非刺激性全唾液于无菌平板培养皿中，而后迅速分装至无菌I. 5mlEP管中，立 即置-70°C保存待用。以该方法采集食管癌患者30例，同期采集正常人或食管良性病变10 例。
[0094] 取食管鳞癌患者唾液样本约300ul，3000g/分钟离心15分钟，取上清加入适量的 ExoQuick外泌体提取溶液，应注意需4°C过夜或稍延长放置时间后，根据实施案例一中所 示的步骤将唾液标本中外泌体提取出来，在使用ExoQuick外泌体提取溶液时，应注意吸除 上清后，可继续12000转/分空转5分钟后，使沉淀尽可能的析出。
[0095] 运用NanoSight分析外泌体成分含量（如图6所示），即每300ul唾液可获得约 20-25uL的外泌体，颗粒数约为6X10 8,在使用Direct-zol?RNA MiniPr印kit从外泌体中提 取RNA时，应注意最后运用无DNase/RNase-Free水冲洗时，可利用冲洗后的所得液体再次 冲洗2-3次，以得到更高浓度及纯度的RNA，浓度约100-150ug/ul，反转录成cDNA，然后运用 上述所提到的食管癌特异性诊断标志物G0LM1-MAK10,利用RT-PCR进行检测或通过PCR扩 增并使用DNA电泳，使用凝胶成像系统将电泳后的胶拍摄成图像，然后进行分析。如图7所 示，食管癌患者较良性食管疾病唾液中运用外泌体所得G0LM1-MAK10的表达量明显要高， 且P值有统计学意义。图中**示P值〈0.01。
[0096] 实验三、通过检测唾液中的PTPRO的RNA含量，对于食管癌患者进行分层。
[0097] 采用滴取法收集受试者非刺激性全唾液。唾液收集在早晨、空腹、安静房间里进 行。嘱咐受试者用清水30ml漱口以清除口腔内残渣，吐尽残留液体，5分钟后使唾液自然流 出。收集其非刺激性全唾液于无菌平板培养皿中，而后迅速分装至无菌I. 5mlEP管中，立 即置-70°C保存待用。以该方法采集食管癌患者30例。
[0098] 取食管鳞癌患者唾液样本约300ul，3000g/分钟离心15分钟，取上清加入适量的 ExoQuick外泌体提取溶液，应注意需4°C过夜或稍延长放置时间，根据实施案例一中所示 的步骤将唾液标本中外泌体提取出来，在使用ExoQuick外泌体提取溶液时，应注意吸除上 清液后，可继续12000转/分空转5分钟后，使沉淀尽可能的析出。运用NanoSight分析 外泌体成分含量。即每300ul唾液可获得约20-25uL的外泌体，颗粒数约为4-10X108,在 使用Direct_zol?RNAMiniPrepkit从外泌体中提取RNA时，应注意最后运用无DNase/ RNase-Free水冲洗时，可利用冲洗后的所得液体再次冲洗2-3次，以得到更高浓度及纯 度的RNA，浓度约100-150ug/ul，反转录成cDNA，然后运用食管癌患者特异性分层标志物 PTPRO引物进行RT-PCR检测或通过PCR扩增并使用DNA电泳，使用凝胶成像系统将电泳后 的胶拍摄成图像，然后进行分析。
[0099] 图8示出了两例放化疗敏感患者与两例放化疗抵抗患者的PTPRO的PCR结果。通 过总的数据分析得出，PTPRO高表达的食管癌患者较PTPRO低表达食管癌患者对放化疗的 敏感性更好。
[0100] 实验四、通过提取乳腺癌外周血中外泌体的PTPRO的RNA，对乳腺癌进行诊疗。
[0101] 实施步骤1临床标本收集
[0102] 采集对象：100例乳腺癌患者手术前外周血及手术后外周血均来自医院的临床病 例资料完整的患者，均为女性，平均年龄（47±9)岁。其中，早期乳腺癌病人40例，晚期乳 腺癌病人60例，所有患者术前均未接受放疗或化疗。同期采集30例正常人的外周血作为 对照组。
[0103] 具体方法如下：分别抽取乳腺癌患者及乳腺良性病变或正常患者抗凝外周血2毫 升，使用eppendorfCentrifuge5417R低温台式离心机，2500转/分钟，离心15分钟，收集 上层血清，_80°C保存，做好登记。
[0104] 实施步骤2外泌体提取制备
[0105] 取乳腺癌、良性乳腺疾病患者以及正常人外周血约250ul，3000g/分钟离心 15min。用移液器将离心所得上清液移至新的离心管，直接加入适量的ExoQuick外泌体沉 淀溶液混匀，室温孵育30分钟或4°C混匀2-3小时后静置过夜，其中的ExoQuick外泌体沉 淀溶液与外周血比例如下：
[0106]
[0107] 将孵育完后的离心管放入离心机中，1500g/分钟离心30分钟后，可以看到外泌体 在离心管底部形成白色沉淀。用移液器小心吸除上清，并将含有剩余ExoQuick溶液的离心 管再次离心，1500g/分钟离心5分钟。小心移除离心管内所有的液体，注意不要碰到外泌 体白色沉淀物。应注意可继续1500g/分钟空转5分钟，使沉淀尽可能析出。将外泌体白色 沉淀物用适量IXPBS重悬得到外泌体重悬液，或用300ulTRizol溶液，-70°C保存。即每 300uL的外周血可获得约20-25uL的外泌体，颗粒数约为6X1011，可用以电镜以及免疫印迹 法确认所提取白色沉淀物是否为所需外泌体，或者进行下一步总RNA提取实验。
[0108] 实施步骤3电镜下确认外泌体
[0109] 将上述所得到的外泌体重悬液取2-3ul稀释10倍后滴20-30ul的于载样铜网上， 室温下静置1分钟，用滤纸从侧面吸干液体，直接滴加20mL/L磷钨酸溶液（pH6. 8)约30yL 于铜网上，室温下负染1分钟.滤纸吸干负染液，白炽灯下烤干约10分钟，透射电镜下观察 照相。（外泌体大小为40~IOOnm)。
[0110] 实施步骤4免疫印迹确认外泌体
[0111] 将上述所得到的外泌体重悬液取适量加入300ul~400ul含有蛋白酶抑制剂 的RIPA裂解液，置于冰上晃动30分钟，再以12000g/分钟离心15分钟，收集上清液，可 于-80°C保存待用（ReagentA)。将收集的待测蛋白样品用IXPBS稀释12倍，漩涡混 匀；将标准品（常用0.025、0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.5及21^/^1)和待测样品分别 吸取20yL加入到96孔板中，并设置空白对照。将待测蛋白样品加入96孔板中，每孔 20uL(ReagentB)，每个样品设置三个重复；将蛋白质定量试剂ReagentA与ReagentB 按50:1的比例混和均匀，现用现配，避光保存。将配好的混和液加入到96孔板中，每孔 160yL;37°C培养箱孵育30分钟后，遮挡摇勾，并冷却至室温，用酶标仪测量0D570,并根据 标准曲线换算样品蛋白浓度。
[0112] 准备蛋白样品，20ug/孔计算，加上样缓冲液5*loading，105°C煮5分钟，蛋白变 性，形成SDS-蛋白复合物，带负电。配制15%分离胶，混匀后，把分离胶加入板中，用Iml的 水压线，室温放置40分钟~1小时。弃除水，且用吸水纸吸干，配制5%浓缩胶2mL，灌胶， 插梳。加入电泳缓冲液Tris-Glybuffer，液面过加样孔，外部液面过电极或扣板。注意是 否出现漏液。点样后，60V，30分钟浓缩蛋白，蛋白压成一条线；当蛋白进入分离胶后，100V， I. 5h；
[0113] 剪取与胶合适大小的NC膜，使用前双蒸水浸泡5分钟，转入4
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0137751... 来自[江苏省常州市电信] 2019年11月01日 14:02感谢分享~BIOG cfRNA Easy Kit提取RNA纯度高，可用于血清、血浆、胸腹水、脑脊液、滑膜液等游离样本中RNA的提取。
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