B同源重组进行基因功能研究及动物疾病模型建立奠定了基础。
【附图说明】
[0037] 图1为本发明实施例2中CRISPR/Cas9打靶载体构建过程。
[0038] 图2为本发明实施例3中4-1BB转基因猪胎儿成纤维细胞筛选。
[0039] 图3为本发明实施例3中阳性细胞单克隆PCR鉴定引物设计策略。
[0040] 图4为本发明实施例3中阳性细胞单克隆短臂PCR鉴定结果，图中M为DNA MARKER:D2000plusDNALadder，N为阴性对照，P为阳性细胞单克隆短臂PCR鉴定结果。
[0041] 图5为本发明实施例3中阳性细胞单克隆长臂PCR鉴定结果，图中M为DNA MARKER:D2000plusDNALadder，N为阴性对照，P为阳性细胞单克隆长臂PCR鉴定结果。
【具体实施方式】
[0042] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0043] 若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技 术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0044] 实施例I4-1BB同源重组载体的构建
[0045] 构建4-1BB同源重组载体的步骤，包括以目标生物基因组为模板，PCR扩增左右同 源臂，4-1BB调控序列，胚胎期特异性调控元件0CT4。将同源左臂、4-1BB表达框、含LoxP位 点的Cre、Neo表达框、同源右臂、负筛选DTA依次连接，形成4-1BB同源重组载体p4B0CNDR。 具体构建过程如下：
[0046] 取生产性能测定优良的约克夏猪耳组织，采用组织块接种法建立猪成纤维细胞 系，命名为YKXOOl，常规细胞传代以及冷冻保存。细胞培养、传代和冻存方法详见《精编细 胞生物学实验指南》（J.S.博尼费斯农等著，章静波等译，2007年，科学出版社）。
[0047]同源左臂（5'arm)扩增：利用已公布的猪基因组序列（GenBank:NW_003612282)， 设计同源左臂扩增引物，5-F:5' -TATCATATGTCGTTTGTTACGCTGGAAGGGGAAG-3'(SEQID NO. 7)，下划线部分为NdeI限制性内切酶；5-R:5'-TATTACGTACTACGATATCGCTTAGGTGTTGCCT GGACTCATTTCC-3'（SEQIDNO. 8)，下划线部分依次为SnaBI和EcoRV限制性内切酶。提取 上述成纤维细胞系YKXOOl基因组DNA，以其为模板，扩增同源左臂。PCR产物为rosa26基 因内含子1中一段长度为1197bp的序列，作为同源左臂（具体序列见SEQIDNO. 1)。
[0048] 同源右臂（3'arm)扩增：按照上述方法设计引物，3-F:5'-TATGGCGCGCCACTGCGAT TGGACCTGAGG-3'（SEQIDNO. 9)，下划线部分为AscI限制性内切酶；3-R:5'-TATGCGGCCGCA TGGTTAATTAAGGGACAGTACTGATAGTCAGCCTCTTGC-3'（SEQIDNO. 10)，下划线部分依次为NotI 和PacI内切酶。PCR产物为rosa26基因内含子1中一段长度为6395bp的序列，作为同源 右臂（具体序列见SEQIDNO. 2)。
[0049] 4-1BB表汰框扩增：4-F:5' -TATGATATCCGGACGATCTGTCTACAACCCACAC-3'(SEQID NO. 11)，下划线部分为EcoRV限制性内切酶；4-R:5'-TATGGCGCGCCAATTTAGGTACCGTTAGGTGC TCCACGAMAACTGC-3'（SEQIDNO. 12)，下划线部分依次为AscI和KpnI限制性内切酶（4-1BB 表达框具体序列见SEQIDNO. 3)。
[0050] 0CT4启动子扩增：利用已公布的猪0CT4调控序列，设计引物并添加上LoxP序列， O-F:5 '-TATGGTACCGCGCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGGTGGTTCAGCGGTAATGAACC-3'（SEQIDNO. 13)，下划线部分为KpnI限制性内切酶，粗体部分为LoxP序列；O-R:5'-TAT GCGGCCGCAAATTTGGCGCGCCAAATTTCATATGAGAAGGCGAAGTCGGAAGCCAGGTG-3'(SEQIDNO. 14)， 下划线部分依次为Notl，AscI和NdeI限制性内切酶。PCR产物为3475bp序列。
[0051] Cre扩增（含 3' 调控元件）：C-F:5' -TATCATATGATGCCCAAGAAGAAGAGGAAGG-3'(S EQIDNO. 15)，下划线部分为NdeI内切酶；C-R:5'-TATGGCGCGCCAATTGAATTCCTAATCGCCATC TTCCAGCAGGC-3'（SEQIDNO. 16)，下划线部分为AscI和EcoRI内切酶。
[0052]Neo表达框扩增：N-F:5' -TATGAATTCGCGACTCTAGATCATAATCAGC-3'(SEQID NO. 17)，下划线部分为EcoRI内切酶；N-R:5'-TATGGCGCGCCGATAACTTCGTATAGCATACATTATAC GAAGTTATCAACACCGTGCGITTTAITCTGTC-3'（SEQIDNO. 18)，下划线部分为AscI内切酶，粗体 是LoxP位点。
[0053]DTA表达框扩增：D-F:5' -TGTTAATTAAAATTCTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTC-3'(SEQ IDNO. 19)，下划线部分是PacI内切酶；D-R:5'-TATGCGGCCGCGGTACCGCCTCAGAAGCCATAGAGC-3'（SEQIDNO. 20)，下划线部分是NotI内切酶。
[0054] 以pd2EYFP-Nl为载体骨架，第一步利用NdeI和KpnI插入同源左臂5'arm，同时 引入EcoRv酶切位点；第二步利用EcoRV和KpnI插入4-1BB表达框；第三步先利用EcoRI 和NotI将Neo表达框与Cre基因连接起来，再利用NdeI和NotI将其连在0CT4启动子下 游，组成LoxP-〇CT4-Cre_3'utr-SV40_Ne〇-3'utr-LoxP，利用KpnI和NotI将上述双框连 到含4-1BB的骨架载体上，同时引入AscI酶切位点；第四步利用AscI和PacI插入同源右 臂3'arm;第五步利用PacI和NotI插入DTA表达框，构建成p4B0CNDR同源重组载体。测 序验证其正确后，扩大培养，去内毒素大提。
[0055] 实施例2 CRISPR/Cas9打靶载体的构建
[0056]根据CRISPR革巴序列设计网站（http://crispr.genome-engineering,org/)对猪 rosa26位点第一内含子的打革EU立点进行预测分析。从候选革G位点中选出一个评分最高的序 列，命名为targetl。其序列和反向互补序列分别是TCCAGTCCCAGACATAGCAT(SEQIDNO. 21) 和ATGCTATGTCTGGGACTGGA(SEQIDNO. 22)，分别合成互补配对的寡居核苷酸。如表1所示， 其中下划线为酶切位点。
[0057] 表1寡聚核苷酸序列
[0058]
[0059] 将合成的一对寡聚核苷酸序列稀释至100yM，按10yL反应体系，分别取IyL，加 入IOXPCRbuffer，混匀，退火处理，94°C，5min;37°C，IOmin;4°C，5min。得到的退火产物 即可与BbsI酶切过的pX330骨架连接。常规转化方法参照《分子克隆实验指南》（J.萨姆 布鲁克著，黄培堂译，2002年，化学工业出版社）。
[0060] 表2退火反应体系
[0061]
[0062] 挑取单克隆，测序验证其正确后，扩大培养，去内毒素大提。CRISPR/Cas9打靶载体 构建过程如图1所示。
[0063] 实施例3 4-1BB转基因细胞系的制备与鉴定
[0064] 选用性别为公的50日胎龄的约克夏猪皮肤成纤维细胞系，细胞复苏、培养和传代 参照《精编细胞生物学实验指南》（J.S.博尼费斯农等著，章静波等译，2007年，科学出版 社）。待细胞生长汇合至80%左右，消化收集细胞（约IXIO6个），加入实施例1和2中构 建的载体各2yg和100yLNucleofector试剂混勾，加入电击杯中，用A-024程序进行电 击转染。然后按1:20接种至IOcm培养皿中，37. 5°(：，5%0)2培养箱中培养。24h后更换含 500yg/mLG418的完全培养基（10%FBS+DMEM)，每3~4天换液一次，96h后G418浓度增 加到800iig/mL。培养至第8天可见克隆点形成。第10~11天镜下标记克隆点位置，用细 胞克隆环将其消化，接种到24孔板。待其汇合度达90 %，消化细胞，一部分留在原孔继续培 养用于鉴定其整合位点，另一部分接种到6孔板用于细胞冻存。筛选过程如图2所示。
[0065] 对所得到的40个细胞克隆进行鉴定：
[0066]PCR鉴定引物设计策略见图3。短臂引物SF:5'-CGCACCCTTACCTTGTCCCA-3'，该引 物位于同源臂上游；短臂引物SR:5'-GAAGGTGGGATGGAGGGTGA-3'，该引物位于4-1BB启动子 上，PCR产物大小为2500bp。长臂引物LF:5' -ACCGCTTCCTCGTGCTTTAC-3'，该引物位于Neo 基因上；长臂引物LR:5' -AGCTGCCTC