CTGTGATTACC-3'，该引物位于同源臂下游，PCR产物大 小为8000bp。消化24孔板单克隆细胞，提取基因组，以野生型猪成纤维细胞基因组为阴性 对照，用KOD聚合酶对长、短臂进行扩增，0. 8%琼脂糖电泳检测结果。PCR鉴定结果分别如 图4、图5所示。其中阳性克隆为1个，状态良好，适宜做核移植供体细胞。
[0067] 实施例4核移植胚胎构建及转基因猪的制备
[0068] 克隆胚胎的构建与移植方法参照李秋艳（2008)、李俊（2010)等人的博士论文中 的描述。具体如下：
[0069] 1.猪卵母细胞体外成熟
[0070] 从屠宰场取卵巢，放入28°C~35°C含青霉素和硫酸链霉素的生理盐水中，在2h内 运回实验室，用配有18号针头的20mL注射器抽吸卵巢上3~6mm的卵泡。将抽取液放入 50mL离心管，37°C静置15min去上清，加入冲卵液PVA-DPBS重悬沉淀，静置15min，去上清。 将重悬液加入直径60mm塑料培养皿中，在体式显微镜下，用口吸管挑选胞质均勾，卵丘致 密且包裹2层以上的卵丘细胞-卵母细胞复合体（COCs)，用成熟培养液洗涤3次，转入在培 养箱中已平衡2h以上的培养液滴内（每100液滴放25枚）。用胚胎级矿物油覆盖，置于 39°C，5%C02，100%湿度的培养箱培养42~44h。
[0071] 2?体细胞准备
[0072] 利用血清饥饿法，将实施例3中获得的打靶阳性细胞待其生长至80%汇合时，进 行血清饥饿处理，即把培养液中的FBS浓度从20 %降至0. 5 %继续培养2~5天，常规消化， 离心洗涤，最后加ImL显微操作液重悬细胞沉淀备用。
[0073] 3?卵母细胞去核与核移植
[0074] 利用盲吸法进行成熟卵母细胞去核，把供体细胞以及成熟卵母细胞同时转入 39°C，5%C02，100%湿度的培养箱平衡lOmin，然后在装配有显微操作仪及恒温台的倒置显 微镜上用固定吸管吸持卵母细胞，用去核/注射针吸取第一极体及其附近可能含有卵母细 胞核的胞质。然后挑选折光性强、表面光滑的体细胞，从去核时裂口处放入卵周隙，用注射 针点压透明带。每批操作30个卵母细胞，结束后将供体细胞-卵胞质构成的重构卵转移到 培养液PZM3中，在39°C，5%C02,100%湿度的培养箱中恢复lh。
[0075] 4?融合与激活
[0076] 将恢复好的重构卵转移到融合液中平衡2min，用融合/激活液洗涤3遍，每批 5~8个放入已经铺满融合液的融合槽中，使供体细胞一受体卵细胞膜接触面与电极平行， 100ys，I. 4kv/cm的直流电脉冲诱导融合，用PZM3培养液洗涤3遍，立即转入矿物油覆盖的 胚胎培养液中，放入39°C，5%C02,100%湿度培养箱中培养4h，在体视显微镜下判定融合。
[0077] 5?胚胎培养
[0078] 将融合的重构胚用胚胎培养液洗涤5遍，转入预平衡2h以上的胚胎培养液PZM3 中，在39°C，5%C02,90%N2,饱和湿度条件下培养至48h和168h时，记录卵裂和囊胚情况。
[0079] 6?胚胎移植
[0080] 用公猪试情结合压背反应，挑选自然发情母猪。用刀片将手术切口部位（尾部倒 数第2对和第3对乳头之间）的毛刮干净，用碘酒棉球消毒2min，再用酒精棉球脱碘。铺上 创巾，沿腹中线方向切开7~IOcm的切口，钝性分离肌肉组织和脂肪组织。用两把止血钳 固定住腹膜后，在之间将腹膜切开，用手指将子宫夹出，并导出卵巢查看排卵情况。同时，将 克隆胚胎从保温箱中取出，在显微镜下，将胚胎转移至胚胎移植管中，尽量少带培养液。然 后将胚胎移植管从输卵管伞口探入输卵管至少5cm大致壶腹-峡部结合处，将克隆胚胎缓 慢注射到输卵管中。将子宫和输卵管回位，分别对腹膜、白膜、肌肉层和皮层进行缝合，并用 碘酒消毒伤口。术后第10天，肌肉注射800IUhGG，第13天注射500IUPMSG。30天后，B 超检测是否妊娠。
[0081] 克隆猪出生后，采用实施例3中的PCR方法对克隆猪进行鉴定，确定其为4-1BB转 基因猪。
[0082] 上述结果表明，本发明已成功获得上调表达共刺激受体4-1BB分子转基因猪。本 发明提供的4-1BB转基因猪，其T淋巴细胞高表达4-1BB受体，可以增强在受到抗原刺激时 的活化、增殖和效应功能，进而增强宿主的适应性免疫应答，增强疫苗免疫效果。
[0083] 虽然，上文中已经用一般性说明、【具体实施方式】及试验，对本发明作了详尽的描 述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见 的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的 范围。
【主权项】
1. 一种4-1BB基因的同源重组载体，其特征在于，通过以下方法制备得到：以目标生物 基因组为模板，PCR扩增左右同源臂，4-1BB表达框，胚胎期特异性调控元件0CT4 ;将同源左 臂、4-1BB表达框、含LoxP位点的0CT4调控的Cre表达框和Neo表达框、同源右臂、负筛选 DTA依次连接，得到4-1BB同源重组载体。2. 如权利要求1所述的同源重组载体，其特征在于，所述的目标生物为猪；通过以下步 骤制备得到： (1) 以pd2EYFP-Nl为载体骨架，利用NdeI和KpnI插入猪rosa26基因内含子1的同源 左臂，同时引入EcoRv酶切位点； (2) 利用EcoRV和KpnI插入4-1BB表达框； (3) 利用EcoRI和NotI将Neo表达框与Cre基因连接起来，再利用NdeI和NotI将其 连在 0CT4 启动子下游，组成 LoxP-0CT4-Cre-3' utr-SV40-Ne〇-3' utr-LoxP，利用 KpnI 和 NotI将上述双框连到含4-1BB的骨架载体上，同时引入AscI酶切位点； (4) 利用AscI和PacI插入猪rosa26基因内含子1的同源右臂； (5) 利用PacI和NotI插入DTA表达框，构建成p4B0CNDR同源重组载体。3. 如权利要求2所述的同源重组载体，其特征在于，所述同源左臂为猪基因组rosa26 位点内含子1的一段序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示； 所述同源右臂是rosa26位点内含子1的一段序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所 示； 所述4-1BB表达框的序列如SEQ ID NO. 3所示； 所述Cre表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，由胚胎期特异性启动子0CT4调控。4. 如权利要求2所述的同源重组载体，其特征在于，Neo为正筛选标记，其核苷酸序列 如SEQ ID NO. 5所示；所述DTA为负筛选标记，如SEQ ID NO. 6所示。5. 如权利要求3所述的同源重组载体，其特征在于，用于PCR扩增猪rosa26基因内含 子1的同源左臂的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7-8所示； 用于PCR扩增猪rosa26基因内含子1的同源右臂的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO. 9-10 所示； 用于PCR扩增4-1BB表达框的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO. 11-12所示； 用于PCR扩增0CT4启动子的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO. 13-14所示； 用于PCR扩增Cre的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO. 15-16所示。6. 权利要求1-4任一所述的同源重组载体在制备抗病转基因猪中的应用。7. 特异性靶向猪rosa26基因内含子1的sgRNA，其特征在于，其DNA序列如SEQ ID NO. 21所示或如SEQ ID NO. 22所示。8. 含有权利要求7所述SgRNA的DNA序列的CRISPR/Cas9打靶载体。9. 如权利要求8所述的CRISPR/Cas9打靶载体，其通过以下方法制备得到，将SEQ ID NO. 21、22所示的寡聚核苷酸在94°C，5min，再37°C，lOmin，然后4°C，5min ;pX330骨架载体 用限制性内切酶Bbs I进行酶切过夜，回收后，与退火的寡聚核苷酸连接。10. -种4-1BB转基因猪的制备方法，其特征在于，将权利要求1-5任一所述的4-1BB 基因的同源重组载体与权利要求8-9任一所述的CRISPR/Cas9打靶载体共转入猪胎儿成纤 维细胞中，获得经鉴定为定点整合4-1BB基因的阳性细胞；以阳性细胞为核移植供体细胞， 卵母细胞为核移植受体细胞，通过体细胞核移植技术获得克隆胚胎；将克隆胚胎移入猪子 宫内妊娠获得在rosa26基因第一个内含子定点整合有4-1BB基因且自动删除标记基因的 转基因猪。
【专利摘要】本发明提供了一种过表达猪共刺激受体4-1BB载体及其应用。PCR扩增rosa26基因内含子1左右同源臂，4-1BB调控序列，OCT4特异启动子；将同源左臂、4-1BB表达框、含LoxP位点的Cre、Neo表达框、同源右臂、负筛选DTA依次连接，得到4-1BB同源重组载体p4BOCNDR。将该载体与含特异性靶向猪rosa26基因内含子1的sgRNA的CRISPR/Cas9打靶载体共转入猪胎儿成纤维细胞中，以阳性细胞为供体细胞，卵母细胞为受体细胞，通过体细胞核移植技术获得克隆胚胎；将克隆胚胎移入猪子宫内妊娠获得在rosa26基因第一内含子定点整合有4-1BB基因且自动删除标记基因的转基因猪。
【IPC分类】C12N15/85, A01K67/027, C12N15/66
【公开号】CN105087620
【申请号】CN201510547191
【发明人】李秋艳, 索勋, 黄广平, 李志远, 李向清, 刘贤勇, 付怡静, 王一丁, 田秀玲, 索静霞, 胡丹丹
【申请人】中国农业大学
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年8月31日