098] 阶段1?预培养
[0099] 预培养允许再活化菌株和接种生产发酵罐。
[0100] 预培养是在圆锥形烧瓶中实施，从具有耐热性小球藻的一种菌株（菌株UTEX 1663-美国得克萨斯大学奥斯汀分校藻类培养物保藏中心）与600ml培养基的冷冻管开始， 该培养基的组成如下表1中所呈现：
[0101] 表 1.
[0102]
[0103] 在灭菌之前通过添加8NNaOH来将pH调节到7。
[0104] 孵育在28°C±I°C下进行，并且以IlOrpm搅拌（伊孚森莫特顿（INF0RS Multitron)搅拌器）72小时。
[0105] 根据在600nm下的OD测量，在每一圆锥形烧瓶的孵育结束时所获得生物质的最终 浓度为约50-60。
[0106] 阶段2.生产
[0107] 用于实施发酵的参数呈现于下表2中。
[0108]表2.
[0109]
[0110] 步骤1 :以分批模式进行发酵
[0111] 用于分批模式的培养基与用于预培养的培养基（表1)相同，但不含酵母提取物， 并且用NH4Cl代替尿素（下表3)。
[0112] 表 3.
[0113]
[0114] 步骤2:以进料-分批模式进行发酵
[0115] 在分批阶段中还以0.47yg/1培养基的速率添加维生素B12,从而将其以约 400yg/100g干燥生物质的值储存于生物质中。
[0116] 在进料-分批阶段中，完整培养基的供应以低于菌株所允许的消耗速率的速率提 供葡萄糖的连续进料，从而使培养基中的残余含量为零。
[0117] 这个葡萄糖供应速率在"进料-分批"开始时为约2g/LAI/h(Al=在接种之后），并 且在培养结束时其可增加到4g/LAI/h。这个步骤期间的生长y介于0. 07111与0. 08h1之 间。
[0118] 进料溶液中的葡萄糖浓度范围可从400g/L到800g/L。
[0119] 连续、单独或与葡萄糖混合来供应盐。
[0120] 第一次添加必须在该批次结束后尽快进行，但这些盐不能只供应一次，以避免抑 制菌株生长。
[0121] 下表4给出每100g葡萄糖的盐要求：
[0122] 表 4.
[0123]
[0124] 在细胞密度达到80g/l时，停止葡萄糖进料。从而停止培养。
[0125] 将生物质雾化为干物质>95%。
[0126] 实例2.由耐热性小球藻产生的氧化敏感性代谢物的室温稳定性研究
[0127] 出于研究从在异养（通过发酵）或在自养（光生物反应器）中所获得生物质提取 的类胡萝卜素、叶黄素、维生素B9并且更特别地是维生素B12的含量进展的目的，在室温下 实施稳定性研究持续14个月和23个月的一个时段。
[0128] 此研究显示小球藻培养方法对这些氧化敏感性代谢物的稳定性的效应。
[0129] 比较以下两种生物质：
[0130]-第一生物质是根据实例1的条件产生的，
[0131] _第二生物质是在一个光生物反应器（例如PBR4000)中于常规条件中产生（普 尔兹（Pulz)等人，2000,雷姆H. -J.(RehmH. -J.)、里德G.(ReedG.)(编辑），生物技术 (Biotechnology)，第 10 卷，第二版，韦因海姆（Weinheim)，105-136)。
[0132] 对100g在这两种操作条件下产生的DM(干物质）大于95%的生物质执行测量。
[0133] 总萝卜素和叶黄素的含量进展（通过HPLC执行测定）
[0135] 在异养下获得的生物质中，总类胡萝卜素的稳定性较高。
[0136] 针对叶黄素观察到相同趋势；经发酵的生物质为叶黄素提供抵抗降解的更佳保 护。
[0137] 维生素的含量进展（根据方法AOAC952. 20 -维生素B12执行分析）
[0138] 异养下由培养基供应的维生素B12由耐热性小球藻的生物质充分同化；在此情形 下，其含量为约363yg/100g干燥生物质。
[0139]
[0140] nd表示未测定。
[0141] 在这两种情形的研究中始终观察到维生素B12的稳定性。对于在异养下产生的 生物质，这些值在约300yg/100g附近变化，并且对于在自养下产生的生物质，这些值在约 105yg/1400g附近变化。
[0142] 叶绿素的含量进展（通过分光光度法测定）
[0143]
[0144] 叶绿素B的含量在两种操作条件中保持稳定，但叶绿素A的含量并非如此，而是在 通过发酵产生的生物质中的稳定性显著更佳。
[0145] 总而言之，由微藻产生的代谢物在通过发酵产生的生物质中更稳定（这反映了它 们针对其所敏感的氧化降解的更佳保护）。
[0146] 这个现象对于叶黄素含量来说更为明显，叶黄素含量在经发酵的生物质中显著更 稳定（而在自养下产生的生物质中降解80%以上）。
【主权项】
1. 一种稳定或储存选自下组的氧化敏感性代谢物的方法，该组由以下各项单独地或组 合地组成：诸如叶黄素等类胡萝卜素、诸如棕榈油酸、油酸或亚油酸等单不饱和和多不饱和 脂肪酸、诸如叶绿素A和B等叶绿素色素、以及诸如维生素B9和B12等维生素，更特别地是 类胡萝卜素，所述方法包括： -在异养条件下使微藻生物质发酵，该异养条件包括缺乏营养因子的培养阶段；并且 -储存干燥生物质，在该干燥生物质中这些氧化敏感性代谢物是稳定的。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于这些微藻是选自小球藻（Chlorella)属、更 特别地是耐热性小球藻（Chlorella sorokiniana)的微藻组。3. 根据权利要求1和2中任一项所述的方法，其特征在于该方法不包括向所述干燥生 物质中添加外源性抗氧化剂或稳定剂。4. 根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其特征在于该缺乏的营养因子为含碳源。5. 根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其特征在于在异养条件下产生该微藻生 物质的方法包括： 〇以分批模式进行发酵的第一步骤， 〇以进料-分批模式进行发酵的第二步骤，在该含碳源由微藻完全消耗时该第二步骤 涉及以比由这些微藻消耗所述含碳源的速率低的速率连续供应所述含碳源。6. 根据权利要求1到5中任一项所述的方法，其特征在于该缺乏的营养因子为葡萄糖， 并且特征在于以高于lg/1/h的速率、优选地以介于lg/1/h与5g/l/h之间、更特别地介于 2g/l/h与4g/l/h之间的速率将该缺乏的营养因子供应到该培养物中。7. 根据权利要求1到6中任一项所述的方法，其特征在于该缺乏性培养阶段的持续时 间为至少lh、优选地至少10h、更优选地至少20h、尤其介于30h与60h之间。8. 根据权利要求1到7中任一项所述的方法，其特征在于该储存步骤在室温下持续至 少12、18或24个月。9. 根据权利要求1到8中任一项所述的方法，其特征在于该氧化敏感性代谢物为叶黄 素。10. -种在异养条件下产生的微藻生物质用于稳定其氧化敏感性代谢物的用途，该异 养条件包括缺乏营养因子的培养阶段。11. 根据权利要求10所述的用途，其特征在于这些微藻是选自小球藻属、更特别地是 耐热性小球藻的微藻组。12. 根据权利要求10或11所述的用途，其中该缺乏的营养因子为含碳源。13. -种通过如权利要求1到9中任一项所述的方法获得的小球藻属、更特别地是耐热 性小球藻的微藻生物质，其特征在于在不向所述干燥生物质中添加外源性抗氧化剂或稳定 剂的情况下，在室温下储存至少12、18或24个月之后，其含有至少Ig叶黄素/kg生物质。
【专利摘要】本发明涉及一种稳定微藻生物质的方法，该生物质含有选自下组的氧化敏感性代谢物，该组由以下各项单独地或一起地组成：类胡萝卜素(叶黄素等)、单不饱和和多不饱和脂肪酸(棕榈油酸、油酸、亚油酸等)、叶绿素色素(叶绿素A和B等)和维生素(维生素B9和B12等)，更具体地是类胡萝卜素，所述方法包括在异养条件下使所述生物质发酵。
【IPC分类】C12P7/64, C12P19/42, C12P23/00, C12P17/18, C12N1/12
【公开号】CN105102608
【申请号】CN201480019200
【发明人】加布里埃·马卡尔
【申请人】罗盖特兄弟公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2014年3月27日
【公告号】WO2014154785A1