EQIDN0:1)中的位置77 的氨基酸色氨酸（密码子TGG)被变为苯丙氨酸（密码子TTT)。根据蛋白PF0012的同源蛋 白NucS的分析，PF0012中的位置77的色氨酸据信是ssDNA结合区域灯heEMB0Journal, 2009，vol. 28，p. 2479-2489)dPF0012蛋白的突变体（W下，称为突变体W77巧的氨基 酸序列显示于沈QIDNO:2。
[006引作为用于引入突变的引物，制备沈9 10^:15和16中显示的皿11尸1和皿111?1。使 用祀T-OP巧F12作为模板、上述引物和PrimeSTAR(注册商标）诱变基础试剂盒（由TAKARA BIOINC.制造）进行PCR。因此获得的扩增反应混合物用于转化大肠杆菌JM109。从表现 出氨节青霉素抗性的克隆获得用于表达突变体W77F的质粒祀T-OP巧F12-W77F。
[0069] (2)突变体W77F的表达和纯化 W与上述野生型蛋白PF0012的那些相同的方式进行突变体W77F的表达和纯化，除了PET-〇ptPF12-W77F用作质粒。
[0070] 实施例2 :蛋白PF0012的错配切割活性 (1)用于测量切割活性的底物的制备-1 为了测定蛋白PF0012的错配切割活性，制备用于检测活性的底物。
[007。 将两种合成DNA(-种在其5'末端用FAM标记，且另一种在其5'末端用R0X标记） 进行混合且退火W制备底物。合成四种R0X标记的DNA:R0X-探针-G、R0X-探针-A、R0X-探 针-T和R0X-探针-C。四种R0X标记的DNA的核巧酸序列分别显示于SEQIDN0:17、18、 19和20。ROX-探针-G、ROX-探针-A、ROX-探针-T和ROX-探针-C的核巧酸序列是相同 的，除了从5'末端起的第11个碱基，其中第11个碱基分别是G、A、T和C。合成四种FAM标 记的DNA:FAM-探针-G、FAM-探针-A、FAM-探针-T和FAM-探针-C。四种FAM标记的DNA 的核巧酸序列分别显示于沈QIDN0:21、22、23和24。FAM-探针-G、FAM-探针-A、FAM-探 针-T和FAM-探针-C的核巧酸序列是相同的，除了从5'末端起的第15个碱基（分别是G、 A、T和C)。从运些，选择一种R0X标记的DNA和一种FAM标记的DNA，混合且杂交W制备用 于检测错配切割活性的底物。所述底物是在除了从用R0X标记的碱基起第11个碱基W外 的位置形成碱基对且在第11个碱基的位置具有一个错配碱基对的双链DNA。
[007引 似通过蛋白PF0012的错配切割反应（通过PAGE检测） 制备反应混合物，所述反应混合物含有1 5iiM的一种R0X标记的DNA、1iil5 yM的一种FAM标记的DNA、1 10XExtaq缓冲液[随附TaKaRaExhq(注册商标）， 由TAKARABIOINC.制造]、蛋白PF0012和&0。添加蛋白PF0012和&0,使得反应混合 物的总量变为10yl。将反应混合物在6〇°C解育1小时之后，停止反应。反应混合物在 10%聚丙締酷胺变性凝胶上进行电泳。电泳之后，通过FMBIO(注册商标）（由Hitachi Solutions,Ltd.制造）检测凝胶中的巧光信号。
[007引图1a)显示R0X信号的检巧U。图化）显示来自与用于检测R0X信号的凝胶相同的 电泳凝胶的FAM信号的检测。在图的上部部分，指向R0X的左侧的字母显示使用的R0X标 记的DNA的种类，且具体地，G、A、T和C显示分别使用R0X-探针-G、R0X-探针-A、R0X-探 针-T和R0X-探针-C。指向FAM的左侧的字母显示使用的FAM标记的DNA的种类，具体地， G、A、T和C显示分别使用FAM-探针-G、FAM-探针-A、FAM-探针-T和FAM-探针-C。空白 显示不使用FAM标记的DNA，且仅使用R0X标记的DNA用于反应。
[0074] 在两种系统中，仅当使用具有G-G、G-T、T-G或T-T错配的底物时，才在低分子量区 域中观察到可能对应于切割片段的DNA的巧光信号。该事实显示，蛋白PF0012识别G-G、 G-T、T-G和T-T的位置，且具有切割错配的附近的DNA的两条链的能力。
[0075] 由于来自切割片段的信号没有显示模糊模式，蛋白PF0012可能不具有外切核酸 酶活性。此外，当使用单一巧光标记的DNA时，在低分子量区域中没有观察到巧光信号。因 此，发现蛋白PF0012几乎没有切割单链DNA的活性。
[0076] 发现蛋白PF0012具有对于所述蛋白可W切割的错配碱基的选择性、对于错配的 高特异性和与形成正常碱基对的双链DNA和单链DNA的低反应性。当将蛋白PF0012添加 至核酸扩增反应时，该蛋白对于错配的高特异性是有利的，因为该蛋白不太可能凭借对于 错配的高特异性抑制反应。
[0077] (3)用于测量切割活性的底物的制备-2 为了相继观察PF0012的错配切割活性，制备能够通过被切割而生成巧光信号的底物。 [007引合成沈Q ID N0:25、26、27、28中显示的核巧酸序列的DNA，其中巧灭剂eclipse结 合至5'末端且FAM结合至3'末端：孤-探针-G、孤-探针-A、孤-探针-T和孤-探针-C。 作为用于互补链的模板DNA，制备SEQ ID NO: 29和30中显示的模板-G和模板-T。混合巧 光标记的DNA和模板DNA，W制备在从5'末端起第5个碱基的位置具有错配碱基对的双链 DNA底物。
[0079] (4)通过蛋白PF0012的错配切割反应的相继观察 制备反应混合物，所述反应混合物含有1. 5y1 5yM巧光标记的DNA值D-探针-G、 孤-探针-A、孤-探针-T和孤-探针-C中的任一种）、1 25yM模板-G、2. 5 10 XExTaq缓冲液、蛋白PF0012和&0。添加蛋白PF0012和&0,使得反应混合物的总量变 为25iil。将反应混合物在55°C解育1小时，同时每分钟一次观察巧光强度的变化。通过 使用dermal切cler Dice(注册商标）实时系统测量（由TAKARABI0INC.制造）测量 反应和巧光强度。
[0080] 图2显示逐分钟（minutebyminute)的巧光强度。在未切割的底物中，通过 eclipse巧灭来自FAM的巧光。当蛋白PF0012切割底物时，FAM和eclipse之间的距离增 加，因此观察到来自FAM的巧光。
[0081] 事实上，仅当使用含有G-G或G-T错配的底物时，观察到巧光强度的增加。当使 用含有G-A错配或G-C碱基配对的底物时，没有观察到巧光强度的增加。该实验显示蛋白 PF0012具有切割由G或T构成的错配的活性。对各错配的碱基对的切割活性表示为在反 应开始时的初始速率，即从维持线性的阶段中且通过各底物的巧光强度校正的斜率计算的 值。当比较从图2中显示的曲线计算的反应初始速率时，发现蛋白PF0012对G-G错配的切 害d活性比对G-T错配的切割活性高2倍。
[0082] 实施例3 :PF0012同源蛋白的错配切割活性 (1)PF0012同源蛋白的错配切割反应 检查来自Thermococcusbarophilus和詹氏甲烧球菌的PF0012同源蛋白的错配切割 活性和碱基特异性。W与蛋白PF0012的错配切割反应的相继观察相同的方式，除了PF0012 同源蛋白（蛋白TERMP_01877或蛋白MJ_0225)用作酶蛋白，基于作为指标的巧光强度的增 加观察错配切割活性。
[0083] 作为结果，如图3中显示，发现来自化ermococ州Sbarophilus和詹氏甲烧球菌的 蛋白具有切割由G或T构成的错配位置的活性。
[0084] (4)通过添加蛋白PF0012减少PCR基因扩增中的误差率 蛋白PF0012可W识别双链核酸中的错配的碱基对且切割双链核酸的两条链。该蛋白 是耐热的，因此可W直接添加至高溫反应系统诸如PCR。该蛋白特异性切割PCR过程中生成 的含有错配的碱基对的双链核酸，且由此预期扩增反应过程中误差的发生率受到抑制。
[0085] (1)添加蛋白PF0012 的PCR 将蛋白PF0012添加至用于PCR的反应混合物。反应混合物连同作为模板的嗜热栖 热菌（Thermusthermo地ilus)皿8的基因组DNA和四对引物进行PCR。使用的引物对是 TthlF(沈QIDN0:31)和TthlR(沈QIDN0:32) ;Tth2F(沈QIDN0:33)和Tth2R(沈Q IDN0:34) ;Tth3F(SEQID側：3。和1'地31?(沈QIDN0:36)及Tth4F(沈QIDN0:37) 和Tth4R(沈QIDN0:38)。添加嗜热栖热菌皿8基因组DNA溶液（由TAKARABIOINC. 制造）作为模板、上述引物对和蛋白PF0012。在98°C持续10秒、55°C持续30秒和72°C持 续1分钟的30个循环中，使用TaKaRaTaq(注册商标）HotStartVersion(由TAKARA BIOINC.制造）进行PCR。
[008引 似PCR中的误差率的计算 通过使用NucleoSpin(注册商标）凝胶和PCRClean-up(由TAKARABIOINC.制造） 纯化如上所述扩增的DNA片段。DNA片段进行TA克隆到pMD19(简单）质粒（由TAKARA BIOINC.制造）中。然后，每种扩增的DM片段的96个质粒克隆（总共384个克隆）进行 扩增区域的核巧酸测序。
[0087] 去除不含有目标DNA的序列信息和假设为用于核巧酸测序分析的程序过程中生 成的误差的序列信息之后，将扩增区域的核巧酸序列与原始基因组DNA序列进行比较，W 计算不同碱基的数目。不同碱基的数目除W分析碱基的总数目W获得误差率。
[008引在通过没有蛋白PF0012的PCR扩增的DNA中，128826bp中的71bp是误差且误 差率是0.055%。当在添加蛋白PF0012的情况下进行PCR时，97112bp中的28bp是误差 且误差率是0. 029%。
[0089] 因此，通过核酸扩增生成的误差可W通过仅将蛋白PF0012添加至PCR反应混合物 而减少。
[0090] 实施例5 :突变体W77F的错配切割活性 蛋白PF0012初始具有对于由G或T构成的错配的碱基对的选择性。我们通过将突变 引入蛋白而制备识别进一步限制的错配的碱基对的酶蛋白。
[0091] (1)通过突变体W77F的错配切割反应的相继观察 通过使用上述巧光DNA底物观察到实施例1中制备的突变体W77F的错配切割活性和 碱基特异性。在该实验中，使用突变体W77F替代蛋白PF0012,且组合孤-探针-G、孤-探 针-T和模板-G、模板-T。其它反应条件与实施例2 (4)中描述的相继错配切割活性的测量 中的那些相同。
[009引如图4中显示，突变体W77F充分切割G-G错配，而对G-T错配的切割活性等于或 小于对G-G错配的切割活性的1/20,且没有切割T-T错配。野生型蛋白PF0012对G-T错配 的活性是对G-G错配的活性的约1/2,如图2中显示。因此，突变体W77F具有对G-G错配的 更特异性的切割活性。
[009引实施例6:通过添加突变体W77F特异性扩增非常少量的污染性突变基因 (1)模板质粒的制备 对于突变基因扩增测试，制备作为模板的质粒。
[0094] 从GenbankAcc.NG_017013中显示的人TP53基因区域的序列信息，设计和合成 沈QIDN0:39和40中显示的两个引物：TP53CloneF和TP53CloneR。使用上述引物、作为 模板的人基因组DNA(由ClontechL油oratories,Inc.制造）和PrimeSTAR(注册商标） 服DNA聚合酶扩增该区域。扩增区域的核巧酸序列信息显示于SEQIDN0:41。扩增的DNA 片段进行TA克隆到质粒pMD19(简单）（由TAKARABIOINC.制造）中。因此获得的质粒 被称为pTP53(G)。为了使用pTP53(G)作为模板将TP53基因的扩增区域中的第99个碱基 G改变为A，设计和制备SEQID^:42和43中显示的1口534。和1口5343作为用于引入突变 的引物。作为模板的质粒pTP53(G)、用于引入突变的引物对和PrimeSTAR(注册商标）诱变 基础试剂盒用于制备突变质粒PTP53 (A)，其中将期望位置的G改变为A。
[0095] 似用于特异性突变基因切割的探针的设计和制备 设计用于特异性突变基因切割的寡核巧酸W具有与从向其中引入突变的PTP53(G