一种与凡纳滨对虾低溶氧耐受性相关的snp标记及其筛选和应用
【技术领域】
[0001]本发明设及一种与凡纳滨对邮低溶氧耐受性相关的SNP标记及其筛选和应用，属 于水产动物遗传及分子标记辅助选择育种技术领域。
【背景技术】
[000引凡纳滨对邮（Zi化oenaeusKS/Mawei)也称南美白对邮，隶属节肢动物n，甲壳纲， 十足目，为广溫广盐性热带邮类。因其具有生长速度快、抗逆性强、适应高密度养殖、繁殖期 长等特点，已成为我国最主要的对邮养殖品种。目前，我国凡纳滨对邮养殖主要W传统养殖 模式为主。然而，随着养殖密度的不断加大，传统养殖到了养殖后期极易出现缺氧情况，从 而影响对邮的生长、摄食和蚁皮，造成对邮免疫力、抗病力、消化力下降，出现生长缓慢、死 亡率高等现象。因此，利用遗传育种技术培育耐低溶氧的凡纳滨对邮新品种是解决W上问 题的有效办法。
[0003]遗传标记是指用来区分不同的个体或群体并且能稳定遗传的物质或性状。SNP是 指基因组特定位置上一个碱基的变异，且任一种等位基因在种群中的发生频率高于1%，变 异的形式包括转换、颠换、插入/缺失等。SNP作为第S代分子标记因其具有数量巨大、分 布广泛、共显性、高度稳定、易于自动化规模分析、能显示其他技术无法检测的隐藏多态性、 可能与基因功能相关的众多优点，在分子标记辅助育种中得到广泛应用。如今，SNP分子标 记技术已广泛应用于凡纳滨对邮的遗传育种中，且多集中于凡纳滨对邮一些重要的功能基 因的研究。例如，已有学者利用SNP分子标记技术对凡纳滨对邮AMY基因进行的单核巧酸 多态性研究，发现在凡纳滨对邮AMY基因存在4个SNP位点，分别为AMY基因第4外显子 109bp处T一C的突变、第4内含子46bp处T一C的突变、第5外显子123bp处C一T的 突变和第6外显子8化P处C一T的突变，且运4个SNP位点均与凡纳滨对邮生长性状显著 相关。也有学者研究了凡纳滨对邮的耐寒相关基因TCP-1-eta的多态性，对其与耐寒性状 的关系进行关联分析，发现在TCP-1-eta基因中存在1个SNP位点（C731T)，且该SNP位点 与凡纳滨对邮的耐寒性状显著相关。此外，亦有关于对凡纳滨对邮的免疫相关基因进行SNP 位点分析的报道。但未见有与凡纳滨对邮耐低溶氧性状相关的SNP分子标记的相关报道。
【发明内容】
[0004]本发明旨在提供一种与凡纳滨对邮耐低溶氧性状相关的分子标记，该分子标记可 应用于凡纳滨对邮抗逆性状的分子标记辅助选择育种，能为进行耐低溶氧性状关联研究提 供有用信息，有利于凡纳滨对邮耐低溶解氧性状的遗传改良。
[0005]本发明通过W下技术方案实现：一种与凡纳滨对邮低溶氧耐受性相关的SNP标 记，该SNP标记为SEQIDNO. 1所示核巧酸序列自5'端起第155位碱基A或G。
[0006]本发明的另一个目的在于提供一种用于检测本发明所述的SNP标记的引物对，所 述引物对具体是引物CAT-FP和引物CAT-RP，是W凡纳滨对邮过氧化氨酶（CAT)基因mRNA (GenBank Accession NO. JX162772.1)序列为模板，利用Premier Primier 3.0软件设计所 得。
[0007] 所述引物对的核巧酸序列如SEQIDNO. 2和SEQIDNO. 3所示： (1) 沈QIDNO. 2:CCCGATAACCTGACCACG; (2) 沈QIDNO. 3 :TTCCCAATCTCACTGAACAAAG。
[0008] 所述引物对用于对所述SNP标记所在的片段进行PCR扩增，再通过测序，对该SNP 标记进行检测，进而确定待测凡纳滨对邮该SNP标记位点的基因型。所述引物对还可W作 为检测该SNP标记的试剂盒的组成之一。
[0009] 本发明的第S个目的在于提供一种与凡纳滨对邮低溶氧耐受性相关的SNP标记 的筛选方法，具体步骤如下： (1) W经低溶氧胁迫9化实验后死亡和存活的凡纳滨对邮个体的基因组DNA为模板，利 用本发明所述的引物对，即引物CAT-FP和引物CAT-RP进行PCR扩增，获得扩增片段； (2) 将步骤（1)获得的扩增片段进行测序，得到CAT基因部分序列W及测序峰图，并筛 选出碱基突变位点，即SNP位点； (3)利用chromas软件对测序的峰图进行基因分型分析，若在某一碱基处出现双峰则 说明是杂合型，单峰则是纯合子；用SPSS19. 0软件的卡方检验对凡纳滨对邮低溶氧性耐受 性与基因型间的相关性进行分析。
[0010] 优选的，步骤（1)所述扩增片段的长度为554bp。
[0011] 优选的，步骤（2)中，SNP检测采用直接测序法，对测序后得到的CAT基因部分序列 进行BLACT比对，筛选出碱基突变位点。
[0012] 在上述技术方案中，所述步骤（1)中提取待测凡纳滨对邮的基因组DNA的方法不 受特别限制，可W采用任何已知的基因组DNA提取方法或试剂盒进行。对基因组DNA进行 PCR扩增的条件也不受特别限制，PCR扩增条件可W由本领域技术人员进行优化选择。
[0013] 在上述技术方案中，所述步骤（2 )所述测序具体可W是通过化qman技术、直接测 序、单链构象多态性聚合酶链式反应（PCR-SSCP)及限制性片段长度多态性聚合酶链式反应 (PCR-RFLP)等技术进行测序，实现SNP标记的检测。
[0014] 由于直接测序是一种准确性最高、灵活性强，通量大、检测周期短的检测技术。该 方法只需在SNP位点的两侧设计一对引物，扩增得到的产物，通过测序即可直接检测到SNP 位点。因此，本发明优选采用直接测序的方法进行SNP标记的检测。
[0015] 经上述技术方案所述步骤获得的SNP位点在辅助耐低溶氧凡纳滨对邮选育过程 的应用，具体方法是在凡纳滨对邮的选择育种过程中，对凡纳滨对邮育种候选群体进行SNP 位点分型，结合其他与抗逆性状相关位点的分型信息，优先选择SNP位点为AG型的个体作 为耐低溶氧凡纳滨对邮选育的亲本或者进行规模养殖，避免选择SNP位点为GG的凡纳滨对 邮作为亲本或者进行规模养殖。
[0016] 本发明相对于现有技术的有益技术效果在于： (1)经统计发现，本发明所述SNP标记的位点处基因型为AG的凡纳滨对邮的低溶氧耐 受性显著高于基因型为纯合GG的凡纳滨对邮，进而，通过检测凡纳滨对邮的上述SNP位点， 能够有效地确定其低溶氧的耐受性能；本发明的SNP标记与凡纳滨对邮的耐低溶氧性状紧 密相关，能够有效用于凡纳滨对邮的分子标记辅助育种； (2) 采用本发明技术方案可根据实际育种需求对凡纳滨育种材料进行早期选择，有效 提高育种的效率和准确性，提高凡纳滨对邮繁殖群体的遗传水平，从而能够准确、高效地选 育出抗逆性强的凡纳滨对邮品种； (3) 方法实用性强、基因组DNA提取、测序方法没有特定要求，适用性广。
【附图说明】
[0017] 图1 :实施例中有过氧化氨酶基因第155位点单倍型为AG峰值图。
[0018]图2 :实施例中有过氧化氨酶基因第155位点单倍型为GG峰值图。
【具体实施方式】
[0019] 下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，运些实施例仅用来说明本发明，并 不限制本发明的范围。
[0020] 实施例：本实施例通过对凡纳滨对邮过氧化氨酶（CAT)基因的部分序列进行测序 和Clustal比对，筛查到了 1个SNP位点，筛选的第155位SNP位点为AG型的凡纳滨对邮， 其低溶氧的耐受性显著高于GG基因型个体。该SNP位点可通过直接测序法，在凡纳滨对邮 群体中检测其位点多态性，并分析位点基因型频率与凡纳滨对邮低溶氧耐受性的相关性。 在凡纳滨对