复合纳米微球固相萃取小柱及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分析化学中与蛋白质组学相关的材料富集技术领域，涉及一种介孔Si02/Ti02纳米复合材料的制备方法，主要用于磷酸化蛋白的选择性富集和检测，富集后的样品进行质谱检测，从而大大提高对磷酸化蛋白的检测灵敏度。
【背景技术】
[0002]磷酸化是一个共价磷酸基团可逆结合到一个或者多个氨基酸，这是细胞调控机制中最常见的蛋白质修饰。在生物学理论研宄中，磷酸化作用是调节和控制蛋白质活力和功能最基本、最普遍，也是最重要的机制，参与多种细胞监管功能，如控制细胞周期、信号传导、分化、增殖、改造和新陈代谢作用；在医药学临床实践中，磷酸化蛋白起着诱导内皮细胞的增殖、减少细胞凋亡、增加脑组织缺氧耐受性、促进血管生成等重要医疗作用，参与各类疾病的临床研宄，如肿瘤的研宄以及新的药物靶标的发现等。磷酸化蛋白质组学的研宄是促进其生物学理论与医学应用紧密结合的桥梁。因此，检测被修饰的磷酸化蛋白，对深入研宄其细胞调控机制并将其运用至各类顽疾的调查研发具有极为重要的意义。
[0003]为了分析蛋白的磷酸化作用，已有研宄者用蛋白酶消解蛋白，将所得的肽片段直接通过质谱技术分析D [参见:(a)Pinkse，M.W.H.;Uitto，P.M.;Hilhorst，M.J.;Ooms，Β.;Heck，A.J.R.Anal.Chem.2004，76，3935-3943.(b) Yue，G.E.;Roper，M.G.;Balchunas，C.;Pulsipher，A.;Coon，J.J.；Shabanowitz? J.;Hunt，D.F.；Landers? J.P.;Ferrance，J.P.Anal.Chim.Acta 2006，564，116-122.]目前该方法遇到许多问题:一，，由于消化后的肽混合物过于复杂，磷酸化一般以亚化学计量方式发生，因此非磷酸化肽的丰度要比磷酸化肽高得多；二，用于检测磷酸化肽的质谱分析技术灵敏度低；三，在低寿命的质谱条件下，磷酸根离子的离子化效率在检测方面变得更低。可见，目前的质谱分析技术对于磷酸化肽的检测较为困难。为了解决检测磷酸化肽的各种困难，各种技术都在向磷酸化肽的富集方向发展。[参见:(a) Leitner，A.Trends Anal.Chem.2010，29，177-185.(b)Dunn，J.D.;Reid，G.E.;Bruening，M.L Mass Spectrom.Rev.2010，29，29-54.(c) Rogers，L D.;Foster，L.J.Mo 1.B1syst.2009，5，1122-1129.(d)Han，G.;Ye，M.;Zou，H.Analyst 2008，133，1128-1138.(30)Mamone? G.;Picariello，G.;Ferranti，P.;Addeo，F.Proteomics2010，10，380-393.]
[0004]目前，以共价或非共价相互作用为基础的磷酸化肽富集方法在各项研究中使用。磷酸化肽在固定的金属磷酸盐离子对的相互作用下，通过结合螯合金属离子采用金属离子亲和层析法(IMAC)[参见:(a) Andersson? L ;Porath，J.Anal.B1chem.1986，154，250-254.(b)Posewitz，M.C.;Tempst，P.Anal.Chem.1999，71，2883-2892.]。在金属氧化物和磷酸基团之间的相互作用下，金属氧化物亲和层析(M0AC，例如，二氧化钛、氧化,告)也被用于磷酸化肽的富集[参见:(a) Larsen，KR.；Thingholm? Τ.Ε.；Jensen? 0.N.；Roepstorff，P.; Jorgensen，Τ.J.D.Mol.Cell.Proteomics 2005，4，873-886.(b)Kweon，H.K.;Hakansson，K.Anal.Chem.2006，78，1743-1749.]。虽有报道各种富集方法，但到目前为止，未曾有报道采用相关功能化介孔Si02/Ti02复合纳米材料实现选择性富集。
【发明内容】
[0005]为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种基于功能化介孔Si02/Ti0^合纳米微球的固相萃取小柱及其制备方法，能够用于富集生物体液以及复杂基质中的磷酸化肽。
[0006]技术方案:一种功能化介孔Si02/Ti0^合纳米微球的固相萃取小柱，所述的固相萃取柱的基质为功能化的介孔S12Zt12复合纳米微球，介孔S1 2纳米微球直径为50?150nm，平均孔径为4?5nm，介孔S12纳米微球表面附着T1 2纳米球，T12纳米球直径为3?5nm ;固相萃取柱空管容积为100 μ L?lmL，填装高度为0.2?0.5cm,空管材质为聚烯烃。
[0007]制备所述的功能化介孔Si02/Ti0；^合纳米微球的方法，由原始介孔S12纳米微球经胺基化修饰、T12纳米球经羧基化修饰，然后通过酰胺反应所得，共价化学修饰按以下步骤进行:
[0008](I)介孔S12纳米微球表面胺基化:在无水乙醇溶剂中加入介孔S12纳米微球和3-氨丙基三乙氧基硅烷(APS)，介孔S12纳米微球与APS的质量比为2:1?1: 5，介孔S1^米微球的质量浓度为2mg/mL?20mg/mL，混合后通N 2半小时以排出空气，然后在搅拌作用下于50?90°C条件下反应5?24小时，反应完成后离心分离5min，转速为9000转/min，用乙醇洗涤沉淀物，离心产物真空干燥，得干燥后的胺基化的介孔Si02m米微球；
[0009](2)T12纳米球表面羧基化:在二氯甲烷溶剂中加入制备得到的T1 2纳米球及3-巯基丙酸(MPA)，1102纳米球和MPA的质量比为20:1?4: 1，T1 2纳米球的质量浓度为2mg/mL?20mg/mL，混合后通N2半小时以排出空气，然后在搅拌作用下于10?40°C条件下反应0.5?2小时，反应完成后离心分离5min，转速为9000转/min，用乙醇洗涤沉淀物，离心产物真空干燥，得干燥后的羧基化的打02纳米球。
[0010](3)功能化介孔Si02/Ti02复合纳米微球的制备:在水溶液中加入制备得到的介孔S12纳米微球和T12纳米球以及交联剂1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、琥珀酰亚胺(NHS)，Si02/Ti0,量比为4:1?3: 1，S1 2与EDC、NHS质量比为(20?5):1: 1，介孔S12纳米球的质量浓度为2mg/mL?20mg/mL，混合后通1半小时以排出空气，然后在搅拌作用下于10?40°C条件下反应0.5?2小时，反应完成后离心分离5min，转速为9000转/min，用乙醇洗涤沉淀物，离心产物真空干燥，得功能化介孔Si02/Ti02复合纳米微球。
[0011]所述的一种功能化介孔3102/1102复合纳米微球的固相萃取小柱，制备方法为:
[0012](I)将一片多孔性聚乙烯下筛板放入固相萃取柱空管的底部，聚乙烯筛板孔径为5 ?20 μ m ;
[0013](2)将相当于固相萃取柱空管容积三分之一到三分之二的功能化介孔Si02/Ti02复合纳米微球干法填装入柱内；
[0014](3)在填装的功能化介孔3;102/1102复合纳米微球上放入另一片多孔性聚乙稀上筛板，聚乙烯筛板孔径为5?20 μ m，压紧填料使填装柱高度保持在0.2?0.5cm,制备得到固相萃取小柱。
[0015]所述介孔Si02/Ti02复合纳米微球固相萃取小柱用于富集的步骤包括:在进行富集之前，首先用(5?20)mL甲醇、乙腈或者相应的缓冲溶液活化介孔Si02/Ti02复合纳米微球，然后在负压驱动下使样品溶液流过柱子，采用适量体积清洗液洗去基体的杂质，使用合适的洗脱液把分析物洗脱收集到容器中，然后进行分析。
[0016]与现有的固相富集小柱相比，本发明所提供的功能化介孔Si02/Ti02复合纳米微球固相萃取小柱具有以下优点:
[0017](I)环境友好:本发明的介孔型Si02/Ti02纳米复合材料本身是环境友好的，并且在制备过程中，步骤简单，只需消耗少量的有机溶剂，不会引入其他有毒有害物质；
[0018](2)稳定性好，可再生和重复利用。吸附在介孔型Si02/Ti02纳米复合材料上的目标物能容易地用少量有机溶剂洗脱下来，键合的官能团不会被破坏，可以重复利用。
[0019](3) 二氧化硅被胺功能化可固定磷酸化多肽基团，而二氧化钛通过螯合金属离子捕获、富集。本发明是由经胺基化修饰后的二氧化硅纳米颗粒与经羧基化修饰后的二氧化钛纳米颗粒，通过酰胺化作用结合，从而制得对磷酸化蛋白具有多重富集作用的纳米复合型材料；
[0020](4)在完成发明的过程中，选择酪蛋白作为研宄目标物，对所述固相萃取小柱的各项性能指标进行了反复测试。结果表明对于上述样品中的磷酸化多肽的加标回收率均能达到92% -105%，解吸过程简单，2mL的乙腈或者其盐溶液就可将上述物质洗脱下来，实验结束后，将固相萃取小柱用乙腈、甲醇各5mL依次洗涤，无需其他操作，即可重复使用。
【附图说明】
[0021]图1为功能化多孔硫化锌纳米微球固相萃取柱示意图，图中为:固相萃取柱管1、上筛板2、下筛板3、功能化介孔Si02/Ti02复合纳米微球填料4 ;
[0022]图2为合成得到的介孔型S12纳米微球透射电镜图A(TEM)，T1 2纳米球透射电镜图B以及复合后的介孔型Si02/Ti02纳米复合材料透射电镜图C ；
[0023]图3为Si02、T12、介孔型Si02/Ti02m米复合材料的FT-1R表征图；
[0024]图4为本发明的固相萃取小柱富集后的酪蛋白的质谱图；
[0025]图5为β -酪蛋白没有经过富集的标准质谱图。
【具体实施方式】
[0026]以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0027]下面结合附图，通过具体实施例对本发明进一步详述。
[0028]实施例1:功能化介孔Si02/Ti02复合纳米微球填料的制备
[0029]实验材料:十六烷基三甲基溴化铵，批号为J1315062，购自上海阿拉丁试剂有限公司；油酸钠，批号为20120920，购自国药集团化学试剂有限公司；钛酸正四丁酯，批号为:20140121，购自上海阿拉丁试剂有限公司;1，3，5-三甲苯，批号为:11329044，购自上海阿拉丁试剂有限公司；硅酸四乙酯，批号为:L1306074，购自上海阿拉丁试剂有限公司；2，5-二羟基苯甲酸，批号为J1312017，购自南京化学试剂有限公司；3_巯基丙酸，批号为:38194，购自上海阿拉丁试剂有限公司；胰蛋白酶(1:250)，批号为20130929，上海阿拉丁试剂有限公司；β-酪蛋白，批号为SLBK9882V，上海阿拉丁试剂有限公司；3_氨基丙基三乙氧基硅烷(APS)，批号Κ1220037，上海阿拉丁试剂有限公司；1_乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，批号090M14531V，上海阿拉丁试剂有限公司；琥珀酰亚胺(NHS)，批号MKBG7914V，上海阿拉丁试剂有限公司。
[0030]实验仪器及设备:圆底烧瓶、KQ-500DE超声波清洗器、聚四氟乙烯反应釜、DHG-9143BS电热鼓风干燥箱、DF-101S磁力加热搅拌器、AY120电子分析天平、TGL-16C离心机。
[0031]实验过程:
[0032](l)Si02m米微球的制备
[0033]将3.5ml的2mol/L氢氧化钠溶液和480ml离子水混合于大烧杯中，依次加入1.0g十