邮的抗逆性状选择育种过程中，可针对该处SNP位点，优先选择AG型的个体作 为育种亲本，W提高选种的效率。
[0021] 凡纳滨对邮过氧化氨酶基因中SNP位点155A〉G与低溶氧耐受性的相关性分析，按 照下列步骤进行： (A) 凡纳滨对邮基因组DNA提取；本实施选择采用常规酪氯仿方法； (B) 凡纳滨对邮过氧化氨酶基因SNP位点筛查； (C) 位点155A〉G分型； (D) 155A〉G基因型与低溶氧耐受性性状的相关性分析； (E) 位点155A〉G辅助凡纳滨对邮低溶氧耐受性品种的选育。
[002引具体操作如下： (A)凡纳滨对邮DNA提取。
[0023] 取凡纳滨对邮肌肉约0. 2g，加入400yL1XTE裂解液剪碎，依次加入200yL10% 的SDS、8]iL蛋白酶K(20mg/mL)，37°C裂解30min，再至于55°C消化至澄清透明，约1-化； 往澄清的裂解液中加入等体积酪/氯仿/异戊醇（25:24:1)溶液，颠倒充分混匀，12000rpm/ min离屯、20min;小屯、移取上清液至新的离屯、管中，再加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1)， 颠倒充分混匀，离屯、15min，抽提2到3次；小屯、移取上清液至新的离屯、管中，加入2倍体积 预冷的无水乙醇，颠倒充分混匀，放入-20°C冰箱内静置30min;12000巧m/min离屯、15min， 弃上清，加入70%乙醇洗涂2-3次，每次离屯、2min，室溫惊干，加入150yL1XTEBuffer保 存。用1%琼脂糖凝胶检测样品，紫外分光光度计检测浓度及纯度。
[0024] (B)凡纳滨对邮过氧化氨酶基因SNP位点筛选。
[00巧]利用NCBI中凡纳滨对邮过氧化氨酶基因mRNA (GenBank Accession NO. JX162772. 1)序列，通过Premier Primier 3. 0软件设计得到特异性引物对CAT-FP和 CAT-RP。W经低溶氧胁迫96小时实验后死亡群体和存活群体凡纳滨对邮（44个）基因组 DM为模板，利用上述引物在PCR条件下进行扩增。PCR反应体系为25yL:DNA模板40ng，lOXPCRBurrer (Mg2+plus)2. 5yL，dNTPMix2yL，上游引物 2yL，下游引物 2yL，rTaq 酶（5U/yL) 0.2化。PCR扩增反应程序如下：95°C预变性5min，95°C变性45S，58°C退火 45s，72°C延伸Imin，共进行35个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存。将PCR产物直接送 于上海生工进行测序。
[0026] (0位点184〉6分型。
[0027] 采用直接测序法对凡纳滨对邮进行SNP检测，在某一碱基处出现双峰则说明是杂 合型，单峰则是纯合子，将测序后的序列与Gene Bank中凡纳滨对邮过氧化氨酶基因进行比 对，得出突变纯合型。图1为本实施例中有过氧化氨酶基因第155位点单倍型为AG峰值图。 图2为本实施例中有过氧化氨酶基因第155位点单倍型为GG峰值图。
[0028] (D)18A〉G基因型与耐低溶氧性状的相关性分析。
[0029] 统计经低溶氧胁迫实验96小时后死亡凡纳滨对邮个体（23个)和存活群体凡纳滨 对邮个体（21个)，共44个凡纳滨对邮个体分析位点155A〉G基因型的情况。用SPSS19. 0软 件卡方检验方法分析位点155A〉G与凡纳滨对邮低溶氧耐受性的相关性巧日表1所示)，最终 确定位点155A〉G为AG型的凡纳滨对邮其低溶氧的耐受性显著高于GG基因型个体。
[0030] 表1 155A〉G位点不同基因型频率
[0031] 在耐低溶氧凡纳滨对邮的选择育种过程中，对凡纳滨对邮育种候选群体进行位点 155A〉G分型，结合其他与抗逆性状相关位点的分型信息，优先选择位点155A〉G为AG型的个 体，作为耐低溶氧凡纳滨对邮选育的亲本或者进行规模养殖，避免选择155位点为GG作为 亲本或者进行规模养殖。
【主权项】
1. 一种与凡纳滨对虾低溶氧耐受性相关的SNP标记，其特征在于：该SNP标记为SEQ IDNO. 1所示核苷酸序列自5'端起第155位碱基A或G。2. -种用于检测权利要求1所述SNP标记的引物对，其特征在于：该引物对是引物 CAT-FP和引物CAT-RP，该引物对是以凡纳滨对虾过氧化氢酶（CAT)基因mRNA序列为模板， 利用PremierPrimier3. 0软件设计所得。3. 根据权利要求2所述的引物对，其特征在于：所述引物对中，引物CAT-FP和引物 CAT-RP的核苷酸序列分别如SEQIDNO. 2和SEQIDNO. 3所示： (1) SEQIDNO. 2：CCCGATAACCTGACCACG； (2) SEQIDNO. 3 :TTCCCAATCTCACTGAACAAAG。4. 根据权利要求2或3所述的引物对，其特征在于：所述引物对用于对权利要求1所 述SNP标记所在的片段进行PCR扩增后，通过测序对该SNP标记进行检测，进而确定待测凡 纳滨对虾该SNP标记位点的基因型。5. -种利用权利要求2或3所述引物对对与凡纳滨对虾低溶氧耐受性相关的SNP标记 进行筛选的方法，其特征在于：具体步骤如下： (1) 以经低溶氧胁迫96h后死亡和存活的凡纳滨对虾个体的基因组DNA为模板，利用所 述引物对中的引物CAT-FP和引物CAT-RP进行PCR扩增，获得扩增片段； (2) 将步骤（1)获得的扩增片段进行测序，得到CAT基因部分序列以及测序峰图，并筛 选出碱基突变位点，即SNP位点； (3) 利用chromas软件对测序的峰图进行基因分型分析，在某一碱基处出现双峰则说 明是杂合型，单峰则是纯合子；用SPSS19.O软件的卡方检验对凡纳滨对虾低溶氧性耐受性 与基因型间的相关性进行分析。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤（1)所述扩增片段的长度为554bp。7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤（2)中，对扩增片段的测序采用 Taqman技术、直接测序、单链构象多态性聚合酶链式反应或限制性片段长度多态性聚合酶 链式反应技术中的一种。8. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤（2)中，对扩增片段的测序采用直接 测序法，对测序后得到的CAT基因部分序列进行BLACT比对，筛选出碱基突变位点。9. 一种利用权利要求5所述方法获得的SNP位点辅助耐低溶氧凡纳滨对虾选育的方 法，其特征在于：在凡纳滨对虾的选择育种过程中，先对凡纳滨对虾育种候选群体进行SNP 位点分型，再结合其他与抗逆性状相关位点的分型信息，选择SNP位点为AG型的个体作为 耐低溶氧凡纳滨对虾选育的亲本或者进行规模养殖，避免选择SNP位点为GG的凡纳滨对虾 作为亲本或者进行规模养殖。
【专利摘要】本发明公开了一种与凡纳滨对虾低溶氧耐受性相关的SNP？标记及其筛选和应用。该SNP？标记为SEQ？ID？NO.1所示核苷酸序列自5’端起第155？位碱基A或G；该标记与凡纳滨对虾的耐低溶氧性状紧密相关，能有效应用于凡纳滨对虾的分子标记辅助育种。本发明还公开了用于检测或筛选该SNP标记的引物对。采用本发明技术方案可根据实际育种需求对凡纳滨对虾育种材料进行早期选择，有效提高育种的效率和准确性，从而能够准确、高效地选育出抗逆性强的凡纳滨对虾品种。本发明方法实用性强、适用性广。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105200160
【申请号】CN201510768606
【发明人】刘建勇, 陈晓敏, 傅学丽
【申请人】广东海洋大学
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年11月12日