Dna条形码结合二代高通量测序快速鉴别a型流感病毒亚型的引物组和方法
【技术领域】：
[0001] 本发明设及一种DNA条形码结合二代高通量测序快速鉴别A型流感病毒亚型方法 用的引物组和方法，属于生物基因工程领域。
【背景技术】：
[0002] 根据流感病毒表面糖蛋白血凝素（HA)和神经氨酸酶（NA)的抗原性差异，A型流感 病毒可分为18种HA亚型和11种NA亚型。但由于病毒依赖于RNA的RNA聚合酶缺少校对 功能，导致其在复制过程中基因组的突变率较高。统计数据表明，我国已新发现包括H10N8、 册肥、H7N9在内的Ξ种新发亚型禽流感病毒的感染，每年爆发的数量和季节性的差异也表 明流感在不同宿主间交叉传播也愈加频繁。而传统的基于核酸扩增的鉴定手段往往不能快 速的给予核酸信息，给病毒的全面准确检测带来了极大的挑战。
[0003] 目前，二代高通量测序技术越来越广泛用于病原基因的分析，是大规模监测病毒 基因组进化的重要手段。在流感病毒的研究上，传统方法分析鉴定病毒通常采用化ffmann 等设计的方法扩增流感病毒基因组全长，或者W病毒特异引物扩增分型基因片段，进行 Sanger法克隆测序，该方法耗时长，劳动力成本高，不适合大规模检测使用。而二代高通量 测序不需要大肠杆菌系统进行DNA模板扩增。其基本测序方法是将基因组DNA随机切割成 小片段DNA分子，然后在体外给运些小片段分子的末端连接上接头制成文库避免了Sanger 测序法所需的繁琐克隆过程。同时，DM条形码技术的便捷性大大适应了二代测序技术的 发展，可无需扩增全长进定，且引物使用简单，只需通过使用一段标准DNA片段，在二代测 序技术的辅助下，即可通过测序获取相应的型别信息。
[0004] 研究人员曾用col基因鉴别出了含禽流感病毒的26种野生鸟类，能准确的识别鸟 类宿主禽流感病毒的脱落、研究候鸟流感流行病学的规律和宿主种群生态学。但对病毒亚 型本身的条码技术开发尚未见相应报道。
【发明内容】
：
[0005] 本发明所要解决的技术问题利用DNA条形码理念，寻找A型流感病毒适合的条形 码序列，一方面足够保守能够利用条码引物进行A型流感病毒的大范围扩增，另一方面具 备足够的变异能够区分密切相关的亚型。同时对扩增的条码片段进行高通量测序技术，W 开发更加广谱、便捷的通用流感分型检测技术。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
[0007] 本发明提供了DNA条形码结合二代高通量测序快速鉴别A型流感病毒亚型方法用 的引物组，引物序列如下：
[0008] (1)
[0009] HA-barcoding-F：GGAATGATHGAYGGNTGGTATGGCA
[0010] HA-barcoding-R：ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTTGCA
[0011] 似
[0012] NA-barcoding-F：GTAAAACGACGGCCAGTGRACHCARGARTCIKMR
[0013]NA-barcoding-R：CAGGAAACAGCTATGACCCIIKCCARTTRTCYCTR〇
[0014] 利用上述本发明提供的引物组，还提供一种DM条形码结合二代高通量测序快速 鉴别A型流感病毒亚型的方法，包括下列步骤：
[0015] (1)基因组提取及反转录 [001引 （2)引物设计与PCR扩增
[0017] (3)IonTorrent测序
[0018] (4)生物信息学分析
[0019] (5)系统进化分析与遗传距离计算。
[0020] 所述的基因组提取及反转录具体步骤为：
[0021] 按QIAGenRNA提取试剂盒操作步骤提取RNA，每份病毒RNA样品溶解于50μL的 RNase水，12000巧m离屯、2min，立即开始反转录，WU125' -过gc过过过过gc过gg-3 > 为引物，参照 TaKaRa公司1ststrandcDNASynthesisKitcDNA试剂盒使用说明加入试剂，RT反应条 件为：30°C10min，42°C40min，7(TC15min，-8(TC保存。
[0022] 所述的引物设计与PCR扩增具体步骤为：
[002引在NCBI流感病毒库中，下载16种HA亚型和9种NA亚型的全长序列，同一区域同 一年代只选一株为代表，设计DNA条形码引物，设计的引物和预期目的片段大小具体见下 表：
[0024]
[00巧]利用HA条码引物进行PCR，设置程序为：94°C2min，30个循环怕4°Clmin，52°C，Imin, 72°C3min}，68°ClOmin；
[0026] 扩增NA基因的保守条码片段，因扩增产物G+C含量百分比不同，退火溫度会有差 异，故PCR反应采用touch-down程序：
[0027] 94°C2min；
[0028] 怕4°C30S，53°C30S每个循环递减rC直到45°C;68°C45幻；8个循环
[0029]怕4°C30S，50°C30S，68°C45幻；30 个循环
[0030] 68°ClOmin；
[0031] -20°C保存。
[0032] 所述的IonTorrent测序具体步骤为：
[0033] 上述样本全部扩增完毕后，进行电泳鉴定，用PCR纯化试剂盒进行纯化。分别取 lOOng纯化产物，HA扩增产物用Ion Shear? Plus Reagent Kit进行酶切打断5min(因测序 范围足够，ΝΑ扩增产物不需酶切），酶切产物需加入1. 8倍体积AMPure" XP Beads纯化，然后 HA扩增产物加入Ion X press? Barcode 1接头，ΝΑ扩增产物加入Ion X pressTM Barcode 2接头，E-Gel胶选择片段（约33化p)构建文库。用P]atimun。PCR扩增试剂盒进行文库扩 增，Ion Library TaqMan" qPCR Mix鉴定文库质量。取70 μ L终浓度为50pmol/ μ L的工作 文库Ion化ef System上机，进行油包水PCR和碱裂解法制备单链模板，最后将带有模板 的微粒溶液自动点样至314忍片中，上机Ion torrent PGM进行高通量测序。
[0034] 所述的生物信息学分析具体步骤为：
[0035] 上机测序后经PGM测序仪自动运行得到的测序结果，解析为sff格式的原始文件 fastq格式的测序序列数据。将化stq格式的测序序列进行过滤，筛除低质量序列、过段序 列及错误序列。选取GenBank中批量下载的各亚型流感病毒HA\NA全基因序列作为参考序 列，将测序数据使用化C Genomic Worbench软件比对到参考序列中，通过覆盖参考序列的 序列数量、比例W及参考序列被覆盖的长度判断样品中是否有对应亚型的病毒。
[0036] 所述的系统进化分析与遗传距离计算具体步骤为：
[0037] 构建系统发育树，将测定的序列与GenBank中参考序列在MEGA5.0的化AST中比 对，除去两条引物之外的序列，基于邻接法（nei曲bor-joining method)构建系统进化树， 并且计算遗传距离。运算次数为1000，核酸替换模型为采用国际提倡的K-2P，K2P距离与P 距离相比考虑了转换和颠换的替代率，是在变异很小时区分物种的最佳模型也是生物条形 码联盟推荐使用的距离计算模型。
[0038] 本发明的有益效果：
[0039] 极其多样的流感病毒亚型广泛存在于我们周围的环境和动物体内，其中很多亚型 种类为人类所未知，而发现未知病毒亚型常常受制于病毒常规检测技术的局限性。传统的 流感病毒测序，通常采用HA、NA基因的特异引物获取相应亚型的基因片段，进行克隆，选择 阳性克隆进行Sanger法测序，然后进行序列的比对，方法操作比较繁琐、费时，而且需要大 量的优化，产物得率较低且杂带较多，不适于实际的常规监测或诊断。自从2005年高通量 测序仪问世W来，高通量测序技术不断发展，从通量到读长得到了极大的改善，具有标准化 流水作业的文库构建流程，避免了常规试验中的细菌转化、培养W及单克隆的挑选，而且短 时间内可W获得大量有效的数据。
[0040] 本发明通过对16种不同地域和亚型的A型流感病毒材料的序列进行分析，发现了 可区分各亚型的DNA条码。研究人员曾提出利用条形码序列有效进行鉴别的关键点是种间 的遗传距离必须大于种内，且距离差异大约为10倍。本发明中的HA型间平均遗传距离为 0. 550,高于型内平均遗传距离0. 032。NA型间平均遗传距离为0. 585,均高于型内遗传距离 0. 150。分析系统树显示，各亚型均能自成一支形成单系。
[0041] 本发明利用DNA条形码技术思路，采用传统RT-PCR检测方法，优选touch-down程 序可W快速判定有无流感病毒，并能同时测定A型流感病毒的亚型及致病型，是一种更简 单，更快速流感分型诊断程序。
【附图说明】：
[0042] 图1是包含16种HA亚型的16株不同实验株HA条码区段的RT-PCR扩增结果。Μ DNAMarkerDL2000;l.Η1Ν1;2.肥Ν9;3.册Ν8;4.Η4Ν1;5.册Ν1;6.册Ν5;7.Η7Ν2; 8.册Ν4;9.Η9Ν2;10.Η10Ν7;11.Η11Ν6. ;12.Η12Ν5;13.Η13Ν6;14.Η14Ν5;15.Η15Ν8; 16.Η16Ν3。
[0043] 图2是包含9种ΝΑ亚型的16株不同实验株的ΝΑ条码区段的RT-PCR扩增结果。从 左到右依次为MarkerDL2000;l.Η1Ν1;2.Η4Ν1;3.册Ν1;4.Η7Ν2;5.册Ν2;6.Η16Ν3; 7.册Ν4;8.册Ν5;9.Η12Ν5;10.Η14Ν5;11.Η11Ν6;12.Η13Ν6;13.Η10Ν7;14.Η3Ν8;15.Η15Ν8;16.肥N9;MarkerDL2000。
[0044] 图3是HA核酸文库及不同稀释度标准样品的扩增曲线。1:6. 8ρΜ标准品扩增曲线 2:0. 68ρΜ标准品扩增曲线3:0. 068ρΜ标准品扩增曲线ΗΑ:目标检测文库扩增曲线。
[004引图4是ΝΑ核酸文库及不同稀释度标准样品的扩增曲线。1:6. 8ρΜ标准品扩增曲线 2:0. 68ρΜ标准品扩增曲线3:0. 068ρΜ标准品扩增曲线ΝΑ:目标检测文库扩增曲线。
[0046] 图5是IonTorrent测序仪读取序列数。
[0047] 图6是HA亚型间遗传距离。
[0048] 图7是NA亚型间遗传距离。
【具体实施方式】：
[0049] 本实施例提供一种利用DNA条形码结合二代高通量测序快速鉴别A型流感病毒亚 型方法。
[0050] 1材料和方法
[0051] 1. 1毒株材料（09p血猪流感H1N1，马流感册N8,禽流感肥N9、H4N1、册N1、H7N2、 H9N2、H13N6、H16N3)灭活样本由本实验室保存，册N5、册M、H10N8、H11N6、H12N5、H14N5、 H15N8核酸样本由吉林出入境检疫检疫局惠赠（详见下表）
[0052]
[0053] 1. 2 分子生物学试剂Agencou:rt*AMPure*XPReagent为Thermo公司产品；foieasy MiniKit为QIAGen公司产品；1ststrandcDNASynthesisKitcDNA反转录试剂盒、 ΕΧ-Taq聚合酶、SolutionI连接酶、AgaroseGelDMExtrationKit试剂盒购自TaKaRa 公司；IonShear?PlusReagentKit、IonXpress?BarcodeX、PlatimurrPCRSuperMix、 LibraryAmplificationPrimerMix、IonLibrary'妨娜站fqPCRMix试剂盒均为Life Technologies公司产品。
[0054] 1. 3主要仪器StepOnePLUS巧光PCR仪购自ABI公司。IonChefSystem核