发明进行详细说明。其中实施例涉 及的仪器与试剂如下：Aglientl100 高效液相色谱仪，配备DAD检测器（美国Aglient公 司）；Aglientl260制备液相色谱仪，配备MWD检测器（美国Aglient公司）；Aglientl290 液质联用仪，配备DAD检测器、Q-T0F6538质谱仪（美国Aglient公司）；MettlerAE240电 子分析天平（梅特勒-托利多仪器-上海有限公司）；YXQ-LS-30S II型立式压力蒸汽灭菌 锅（上海博讯实业有限公司）。异长春花苷内酰胺原料药（纯度大于98%，江苏康缘药业 股份有限公司）；HPD100大孔吸附树脂（沧州宝恩有限公司）；色谱纯乙腈（美国TEDIA公 司）；水为Milli-Q超纯水；其它试剂均为分析纯。
[0044] 实施例1 :异长春花苷内酰胺水溶液光照射稳定性研究
[0045] 取异长春花苷内酰胺适量，用超纯水超声溶解，配制成约1. 2mg/ml的溶液，滤过， 将滤液分装至l〇ml的西林瓶中，分成三组，第一组向溶液中充入氮气，第二组向溶液中充 入氧气，第三组为空气，压塞，乳盖，灭菌（温度：121°C;时间20min)。由于光照时间较长， 为排除微生物影响，优选对异长春花苷内酰胺溶液进行高温灭菌。样品放至室温后取样， HPLC检测灭菌前后样品中异长春花苷内酰胺含量，然后将三组样品分别置于室温自然光照 处和避光处保存，7天后分别取样，HPLC检测异长春花苷内酰胺含量。色谱条件：色谱柱 为PenomenexC18 (4. 60X250mm，5μm);流动相为乙腈-〇. 1 %磷酸水，梯度洗脱条件为0~ 3〇111；[11，乙腈15%~32%，30~50111；[11，乙腈32%~95%;流速11]117 /111；[11;柱温30°0;检测波 长226nm;进样量5yL。HPLC检测结果见表1、图1。
[0046] 表1异长春花苷内酰胺在不同情况下的含量
[0048] 注：灭菌前异长春花苷内酰胺的含量为100%
[0049] 由表1结果可见，异长春花苷内酰胺在灭菌前后，含量无明显变化；避光放置后的 三组样品中异长春花苷内酰胺含量均无明显变化，说明异长春花苷内酰胺水溶液在避光条 件下稳定。而自然光下放置的样品中，充氧气和空气的样品中异长春花苷内酰胺含量明显 降低，其中充氧气组降解率达58 %，而充氮气组含量变化不明显，说明异长春花苷内酰胺的 降解与光照和氧气有关。由图1可知，异长春花苷内酰胺在水溶液中主要产生2个降解产 物。
[0050] 实施例2 :
[0051] 称取异长春花苷内酰胺原料0. 7g，用500ml超纯水超声溶解，滤过，滤液分装至 20ml西林瓶中，充入氧气，压塞，乳盖，灭菌（温度：121°C;时间20min)。样品置于自然光 照处放置7天，将反应液过HPD100大孔吸附树脂柱，依次用水、20%乙醇、40%乙醇洗脱，收 集40 %乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得含有主要降解物（图1中1号色谱峰和2号色谱峰）的 干膏262mg;干膏用甲醇溶解，通过制备液相分离，流动相为乙腈-水（15:85)，分别收集含 有1号、2号色谱峰的洗脱液。分离得到的1号降解产物在洗脱液中不稳定，重新分离仍难 得到含单一色谱峰的洗脱液（见图2)。并且将含1号峰的洗脱液放置3天后1号峰的比例 降低，2号峰的比例明显增加，表明1号峰可转化为2号峰。将含有2号色谱峰的洗脱液浓 缩、干燥，干膏用甲醇结晶，得白色的棒状结晶58mg。
[0052] 结构鉴定2号降解物的具体参数如下：HRMS calcd for C1SH1S06[M+H] + :513. 18856， found513. lSeTe.^NMlUDMSO-dejOOMHz)，δ :12.07(s，lH，ΝΗ)，8· 13(d，J = 8· 1Ηz，1Η， H-9)，7.67(m，lH，H-ll)，7.60(d，J = 8.2Hz，lH，H-12)，7.35(m，lH，H-10)，7.05(d，J = 2. 6Hz，1H，H-17)，5. 81 (m，1H，H-19)，5. 48(dd，J = 17. 1Hz，1. 8Hz，1H，H-18)，5. 40(d，J =1. 5Hz，1H，H-21)，5. 35(dd，J = 17. 1Hz，1. 8Hz，1H，H-18)，4. 77(br-d，J = 12. 0Hz，1H， H-13) ,4. 55 (d, J = 7. 9Hz, 1H, Η-Γ ) ,4. 48 (d, J = 14. 0Hz, 1H, H-5) ,4. 33 (d, J = 14. 0Hz, 1H，H-5)，3. 71 (m, 1H, H-6'），3. 44 (m, 1H, H-6'），3. 26 (m, 1H, H-15)，3. 19 (m, 2H, H-5'，H-3'）， 3. 02(m,2H,H-4,,H-2,),2.66 (m,lH,H-20) ,2. 50 (overlapped,H-14), 2. 02 (m, 1H,H-14).13C NMR(DMS0,126MHz)δ172. 9 (C-7)，163. 9(C-22)，149. 5(C-2)，145. 0(C-17)，140. 3(C-13)， 132. 5(C-19)，131. 5(C-11)，125. 2(C-8)，124. 7(C-9)，123. 2(C-10)，120. 4(C-18)， 118. 3(C-12)，112. 9(C-6)，108. 9(C-16)，97. 8(C-1'），94. 8(C-21)，77. 2(C-5'）， 76. 3 (C-3,），73. 1 (C-2,），69. 9 (C-4,），61. 0 (C-6,），59. 4 (C-3)，47. 40 (C-5)，43. 6 (C-20)， 28. 1(C-14)，23.6(C-15).以上数据与短小蛇根草苷（pumiloside)基本一致。
[0053] 实施例3:
[0054] 称取异长春花苷内酰胺原料0. 7g，用500ml超纯水超声溶解，滤过，滤液分装至 20ml西林瓶中，持续通入氧气，KKTC灭菌60min，然后样品置于自然光照处放置7天，将反 应液过HPD100大孔吸附树脂柱，之后依次用水、20%乙醇、40%乙醇洗脱，收集40%乙醇洗 脱液，浓缩，干燥，得粗品〇.6g，粗品用甲醇结晶，得白色棒状结晶，产率70%，纯度90%。对 制得的粗品进行结构鉴定，结果同实施例2。
[0055] 实施例4 :
[0056] 称取异长春花苷内酰胺原料0. 7g，用500ml超纯水超声溶解，滤过，滤液分装至 20ml西林瓶中，充入氧气，121°C灭菌20min，然后样品置于自然光照处放置7天，将反应液 过HPD100大孔吸附树脂柱，之后依次用水、30 %乙醇、60 %乙醇洗脱，收集60%乙醇洗脱 液，浓缩，干燥，得粗品〇. 6g，粗品用甲醇结晶，得白色棒状结晶，广率72%，纯度95%。对白 色棒状结晶进行结构鉴定，结果同实施例2。
[0057] 实施例5 :
[0058] 称取异长春花苷内酰胺原料0. 7g，用500ml超纯水超声溶解，滤过，滤液分装至 20ml西林瓶中，充入氧气，150°C灭菌20min，然后样品置于自然光照处放置7天，将反应液 过HPD100大孔吸附树脂柱，之后依次用水、20 %乙醇、40 %乙醇洗脱，收集40%乙醇洗脱 液，加热回流，回流液浓缩，干燥，得粗品〇. 6g，粗品用甲醇结晶，得白色棒状结晶0. 5g，产 率75%，纯度95%。对白色棒状结晶进行结构鉴定，结果同实施例2。
[0059] 以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对 于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行 若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 一种制备短小蛇根草苷的方法，其特征在于，以异长春花苷内酰胺为原料，在含有氧 气的密封条件下光照放置得到短小蛇根草苷。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述制备方法具体为异长春花苷内酰胺 用水溶解，滤过，滤液装于密封容器中，充入氧气，光照处理后大孔吸附树脂吸附，之后依次 用水、10 %~30 %乙醇、40 %~60 %乙醇洗脱，收集40 %~60 %乙醇洗脱液，浓缩干燥即 得。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括对收集的40%~60%乙醇洗脱液 进行脱水处理的步骤。4. 根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，还包括甲醇结晶的步骤。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在充入氧气后还包括灭菌的步骤。6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述灭菌为KKTC~150°C灭菌0.3h~ lh〇7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述密封容器为西林瓶。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光照为自然光。9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光照处理时间为7天。10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂为HPD100大孔吸附树 脂。
【专利摘要】本发明属于药物化学领域，公开了一种制备短小蛇根草苷的方法。本发明所述制备短小蛇根草苷的方法以异长春花苷内酰胺为原料，在含有氧气的密封条件下光照放置得到短小蛇根草苷。由于异长春花苷内酰胺在胆木中含量非常高，且采用柱层析方法即可分离获得异长春花苷内酰胺，因此本发明所述制备短小蛇根草苷的方法原料来源广泛。而且本发明所述制备方法操作简单、绿色环保，同时短小蛇根草苷收率大于70％。
【IPC分类】C07H17/00, C07H1/00
【公开号】CN105273013
【申请号】CN201410235324
【发明人】萧伟, 王振中, 丁岗, 李兆亮, 刘文君, 孟兆青, 孙林, 杨彪, 齐晓辉
【申请人】江苏康缘药业股份有限公司
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2014年5月29日