min，之后取上清液，并加入10%的胎牛血清和A⑶E培养基，充分搅拌均匀，再放入离心机中，提高转速为550r/mn，离心lOmin后，取上清液获得人体气道上皮肤细胞培养基；接下来将上述得到的人体气道上皮肤细胞培养基，以2X 106细胞/mL的密度接种于消毒后的、铺有胶原蛋白和琼脂的培养板上，设置温度为35°C，在5% C02常氧环境下静置培养10天，即可获得一种治疗支气管哮喘的人体气道上皮细胞。其中所述的IV、ACDE培养基制作步骤为首先在烧杯中倒入1L蒸馏水；然后分别取10g肌醇、0. 05g烟酸、0. Olg盐酸硫胺素、30g蔗糖倒入至蒸馏水中，用搅拌棒充分搅拌溶解；随后用可调动液器吸取0. 2mg吲哚乙酸放入上述溶液中；之后将精密试纸或者酸度计调整pH至5. 7 ;接下来称取6g琼脂粉倒入到上述配好的溶液中，放置在电炉上加热至沸腾，直到琼脂粉溶化为止；稍微冷却后装入培养容器中，并且放入消毒灭菌锅灭菌20min ;最后灭菌后从灭菌锅中取出培养基，等其冷却凝固即可。
[0026]本实例简单易行，使得细胞存活率高达90%，当发生支气管肺癌、慢性支气管炎、支气管扩张、支气管狭窄时，可以通过取本发明所制得的人体气道上皮细胞进行研究，可将组织器官重建或再造，不仅使得细胞再造后存活率达到85%，而且对于基础和临床医学研究与应用有重大意义。
[0027]实例2
[0028]首先取离体人气管或支气管，用消化培养基在4°C下消化31h后收集气道上皮细胞，之后用93%的异丙醇溶液分离清洗组织样品，然后将组织样品放入无菌培养皿中，在解剖显微镜下，用解剖镊子和剪刀去除组织样品中残留的脂肪；随后将上述处理后的组织样品，采用密闭管腔消化法，用消化液对气道上皮细胞进行活性的去除血液和粘液，在37.5°C下消化10h，并不时动摇，使组织消化均匀、完全，之后收集处理后的消化液，所述的消化液为含胶原酶的IV培养基；接下来将上述得到后的消化液放入离心机中，以750r/min的转速，离心18min，之后取上清液，并加入13%的胎牛血清和A⑶E培养基，充分搅拌均匀，再放入离心机中，提高转速为750r/mn，离心13min后，取上清液获得人体气道上皮肤细胞培养基；接下来将上述得到的人体气道上皮肤细胞培养基，以4X 106细胞/mL的密度接种于消毒后的、铺有胶原蛋白和琼脂的培养板上，设置温度为36°C，在8%C02常氧环境下静置培养13天，即可获得一种治疗支气管哮喘的人体气道上皮细胞。其中所述的IV、ACDE培养基制作步骤为首先在烧杯中倒入1L蒸馏水；然后分别取llg肌醇、0.07g烟酸、0.02g盐酸硫胺素、40g蔗糖倒入至蒸馏水中，用搅拌棒充分搅拌溶解；随后用可调动液器吸取0.2mg吲哚乙酸放入上述溶液中；之后将精密试纸或者酸度计调整pH至5.75 ;接下来称取6g琼脂粉倒入到上述配好的溶液中，放置在电炉上加热至沸腾，直到琼脂粉溶化为止；稍微冷却后装入培养容器中，并且放入消毒灭菌锅灭菌25min ;最后灭菌后从灭菌锅中取出培养基，等其冷却凝固即可。
[0029]本实例简单易行，使得细胞存活率高达91%，当发生支气管肺癌、慢性支气管炎、支气管扩张、支气管狭窄时，可以通过取本发明所制得的人体气道上皮细胞进行研究，可将组织器官重建或再造，不仅使得细胞再造后存活率达到86%，而且对于基础和临床医学研究与应用有重大意义。
[0030]实例3
[0031]首先取离体人气管或支气管，用消化培养基在5°C下消化32h后收集气道上皮细胞，之后用95%的异丙醇溶液分离清洗组织样品，然后将组织样品放入无菌培养皿中，在解剖显微镜下，用解剖镊子和剪刀去除组织样品中残留的脂肪；随后将上述处理后的组织样品，采用密闭管腔消化法，用消化液对气道上皮细胞进行活性的去除血液和粘液，在38°C下消化15h，并不时动摇，使组织消化均匀、完全，之后收集处理后的消化液，所述的消化液为含胶原酶的IV培养基；接下来将上述得到后的消化液放入离心机中，以800r/min的转速，离心20min，之后取上清液，并加入15%的胎牛血清和A⑶E培养基，充分搅拌均匀，再放入离心机中，提高转速为850r/mn，离心15min后，取上清液获得人体气道上皮肤细胞培养基；接下来将上述得到的人体气道上皮肤细胞培养基，以5X 106细胞/mL的密度接种于消毒后的、铺有胶原蛋白和琼脂的培养板上，设置温度为37°C，在10% C02常氧环境下静置培养15天，即可获得一种治疗支气管哮喘的人体气道上皮细胞。其中所述的IV、ACDE培养基制作步骤为首先在烧杯中倒入1L蒸馏水；然后分别取12g肌醇、0.08g烟酸、0.03g盐酸硫胺素、50g蔗糖倒入至蒸馏水中，用搅拌棒充分搅拌溶解；随后用可调动液器吸取0.2mg吲哚乙酸放入上述溶液中；之后将精密试纸或者酸度计调整pH至5.8 ;接下来称取6g琼脂粉倒入到上述配好的溶液中，放置在电炉上加热至沸腾，直到琼脂粉溶化为止；稍微冷却后装入培养容器中，并且放入消毒灭菌锅灭菌30min ;最后灭菌后从灭菌锅中取出培养基，等其冷却凝固即可。
[0032]本实例简单易行，使得细胞存活率高达92%，当发生支气管肺癌、慢性支气管炎、支气管扩张、支气管狭窄时，可以通过取本发明所制得的人体气道上皮细胞进行研究，可将组织器官重建或再造，不仅使得细胞再造后存活率达到87%，而且对于基础和临床医学研究与应用有重大意义。
【主权项】
1.一种治疗支气管哮喘的人体气道上皮细胞的培养方法，其特征在于具体操作步骤为: (1)取离体人气管或支气管，用消化培养基在3?5°C下消化30?32h后收集气道上皮细胞，之后用90?95%的异丙醇溶液分离清洗组织样品，然后将组织样品放入无菌培养皿中，在解剖显微镜下，用解剖镊子和剪刀去除组织样品中残留的脂肪； (2)将上述处理后的组织样品，采用密闭管腔消化法，用消化液对气道上皮细胞进行活性的去除血液和粘液，在37?38°C下消化5?15h，并不时动摇，使组织消化均匀、完全，之后收集处理后的消化液，所述的消化液为含胶原酶的IV培养基； (3)将上述得到后的消化液放入离心机中，以500?800r/min的转速，离心15?20min，之后取上清液，并加入10?15%的胎牛血清和A⑶E培养基，充分搅拌均匀，再放入离心机中，提高转速为550?850r/mn，离心10?15min后，取上清液获得人体气道上皮肤细胞培养基； (5)将上述得到的人气道上皮肤细胞培养基，以2?5X 106细胞/mL的密度接种于消毒后的、铺有胶原蛋白和琼脂的培养板上，设置温度为35?37°C，在5?10% C02常氧环境下静置培养10?15天，即可获得一种治疗支气管哮喘的人体气道上皮细胞。2.根据权利要求1所述的一种治疗支气管哮喘的人体气道上皮细胞的培养方法，其特征在于:所述的IV、ACDE培养基制作步骤为: (1)先在烧杯中倒入1L蒸馏水； (2)分别取10?12g肌醇、0.05?0.08g烟酸、0.01?0.03g盐酸硫胺素、30?50g蔗糖倒入至蒸馏水中，用搅拌棒充分搅拌溶解； (3)用可调动液器吸取0.2mg吲哚乙酸放入上述溶液中； (4)将精密试纸或者酸度计调整pH至5.7?5.8 ; (5)称取6g琼脂粉倒入到上述配好的溶液中，放置在电炉上加热至沸腾，直到琼脂粉溶化为止； (6)稍微冷却后装入培养容器中，并且放入消毒灭菌锅灭菌20?30min; (7)灭菌后从灭菌锅中取出培养基，等其冷却凝固即可。
【专利摘要】本发明公开了一种治疗支气管哮喘的人体气道上皮细胞的培养方法，属于生物技术领域。本发明首先取人体气管消化收集气道上皮细胞，并用异丙醇溶液洗净放入培养皿中去污，之后采用消化法进行消化后收集消化液，随后将消化液进行离心处理，取上清液并加入胎牛血清和ACDE培养基混合后再次离心处理，得人体起到皮肤细胞培养基，最后将人体气道上皮肤细胞培养基接种在培养板上，培养后得一种治疗支气管哮喘的人体气道上皮细胞。本实例证明，本发明不仅操作简单易行，操作过程中不会有任何污染，而且不会损伤细胞，使得细胞存活率达到90％以上。
【IPC分类】C12N5/071
【公开号】CN105274050
【申请号】CN201510771532
【发明人】王悦, 张明, 刘磊, 李晶晶, 潘艳, 张治国, 周欢
【申请人】常州大学
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年11月12日