36°C，关闭冷却水；
[0156](5)接菌种悬浮液
[0157]将种子罐的压降至0，除去接种口上的盖帽，在火焰下将摇瓶种子倒入种子罐，拧紧种子罐接种口的盖帽，调整罐压至0.lOmpa ;
[0158](8)移种
[0159]将种子罐底阀至分配站、发酵罐的管道灭菌，管道从发酵罐方通入0.15mpa无菌蒸汽，灭菌20分钟，打开所有管道上的小排气阀；灭菌完毕，打开发酵罐接种阀，通入无菌空气，关闭小排气阀，待管路冷却至接种温度32°C，种子罐底阀，升高种子罐压力至0.15mpa，切换分配站阀门，降低发酵罐压至0.03mpa，将种子液压入发酵罐；接种完毕，调罐压至0.lOmpa，温度32°C，发酵周期160h，移种完毕，用蒸汽冲洗移种管线中的残料，关闭阀门；所述发酵罐中装填发酵料，所述发酵料为处理加工过的黄豆，处理加工过程为:选取黄豆清洗干净，浸泡24小时，磨碎，121°C高温灭菌60min，降温至常温备用。
[0160](7)放罐清洗
[0161]当PH达到7.2，终止发酵，停空气，停搅拌，打开出料阀，发酵液贮罐入料阀，利用压缩空气将料压至发酵液贮罐；料压净后，关闭出料阀，开排污阀，停压缩空气，当罐压为零时，打开人孔，用水清洗罐内所有装置，冲洗完毕通入空气，吹出co2;
[0162](8)过滤
[0163]利用板框压缩，除去菌丝体，至过滤液透明无菌丝，残渣中杂质质量分数小于1% ;
[0164]具体操作步骤为:
[0165]1)检查板框液压系统及装置，将合格滤布平整地铺在板框间；
[0166]2)启动液压栗，顶紧，压力控制在8Mpa;
[0167]3)将发酵液用栗输入板框，起栗时，掀开板框入料阀、回流阀，开贮罐口、栗入口，
起栗；
[0168]4)过滤时，料液要始终保证温度恒定，搅拌不能停止，滤液要保证清晰透明，出料减慢时，证明滤渣已满，停止进料，罐渣吹干后将接收槽内料液排净，堵好出口，启动液压系统，退回板框，清理框内滤饼，洗好滤布，重新装好顶紧。
[0169](9)低温冷冻干燥:
[0170]操作温度在-28°C，操作时间为80小时；
[0171](10)粉碎，分装，包装，储存。
[0172]采用平板法测定酶活，以尿激酶单位计IU，纳豆激酶含量达到2000IU/g。
[0173]以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种采用深层液体发酵提取纳豆激酶的方法，其特征在于，按照如下步骤进行: (1)菌种培养 将保存的纳豆菌菌种进行活化，斜面培养的步骤，收集斜面培养的菌种加入到含有菌悬液的摇瓶中，镜检孢子数达到lX10s-lX107ml ; (2)空消 种子罐经消洗，检查后关闭所有与罐体连通的阀门，盖紧人孔，开三路蒸汽，打开蒸汽阀，排净空气，关闭排气阀，使罐压升至0.10-0.20mpa，打开所有与种子罐有关的小排气阀，排气20-40分钟，再关闭小排气阀，使罐压升至0.10-0.20mpa，然后全开排气阀，待罐压降至0时，打开人孔，排尽管内的冷凝水，关种子罐底阀门，准备进料； (3)投料 关闭种子罐底出料阀，开启罐顶入料阀，关闭取样过滤器，冷却水进口 ；打开配料罐出口阀，输送栗入口，起栗，开启栗出口门上料；上料完毕停栗反吹料液管道，扫净料液管中残料； (4)实消 按空消方式三路进蒸汽，开排气门，当罐压升至0.01-0.03mpa，调节蒸汽门，保持恒温打开所有罐顶通向外面的阀门，排气10-30分钟，关闭蒸汽，打开空气过滤器出口通入罐内，用牛皮纸包扎接种关口，关闭小排气阀，开启冷却水，使罐温降至35-37 °C，关闭冷却水； (5)接菌种悬浮液 将种子罐的压降至0，除去接种口上的盖帽，在火焰下将摇瓶种子倒入种子罐，拧紧种子罐接种口的盖帽，调整罐压至0.05-0.15mpa ; (6)移种 将种子罐底阀至分配站、发酵罐的管道灭菌，管道从发酵罐方通入0.1-0.2mpa无菌蒸汽，灭菌10-30分钟，打开所有管道上的小排气阀；灭菌完毕，打开发酵罐接种阀，通入无菌空气，关闭小排气阀，待管路冷却至接种温度30-35°C，种子罐底阀，升高种子罐压力至0.l-ο.2mpa，切换分配站阀门，降低发酵罐压至0.02-0.04mpa，将种子液压入发酵罐；接种完毕，调罐压至0.05-0.15mpa，温度30_34°C，发酵周期150_180h，移种完毕，用蒸汽冲洗移种管线中的残料，关闭阀门； (7)放罐清洗 当PH达到7.0-7.5，终止发酵，停空气，停搅拌，打开出料阀，发酵液贮罐入料阀，利用压缩空气将料压至发酵液贮罐；料压净后，关闭出料阀，开排污阀，停压缩空气，当罐压为零时，打开人孔，用水清洗罐内所有装置，冲洗完毕通入空气，吹出C02; (8)过滤 利用板框压缩，除去菌丝体，至过滤液透明无菌丝，残渣中杂质质量分数小于1% ; (9)低温冷冻干燥: 操作温度在-25°C —30°C，操作时间为72小时-96小时； (10)粉碎，分装，包装，储存。2.根据权利要求1所述的采用深层液体发酵提取纳豆激酶的方法，其特征在于，所述纳豆菌菌种为枯草芽孢杆菌菌株QR，其保藏号为CGMCC N0.11274。3.根据权利要求1所述的采用深层液体发酵提取纳豆激酶的方法，其特征在于，所述发酵罐中装填发酵料，所述发酵料为处理加工过的黄豆，处理加工过程为:选取黄豆清洗干净，浸泡24小时，磨碎，121°C高温灭菌60min，降温至常温备用。4.根据权利要求1所述的采用深层液体发酵提取纳豆激酶的方法，其特征在于，所述发酵罐中装填发酵料，所述发酵料为处理加工过的红豆，处理加工过程为:选取红豆清洗干净，浸泡36小时，磨碎，121°C高温灭菌60min，降温至常温备用。5.根据权利要求1所述的采用深层液体发酵提取纳豆激酶的方法，其特征在于，所述发酵罐中装填发酵料，所述发酵料为水果，所述水果经过去核或去皮，磨碎，115°C灭菌30min，降温至常温备用，所述水果选自苹果，梨，桃，柿子，杏，柑橘，柚子，橙子，香蕉，西瓜，葡萄中的一种或一种以上。6.根据权利要求1所述的采用深层液体发酵提取纳豆激酶的方法，其特征在于，所述发酵罐中装填发酵料，所述发酵料为蔬菜，所述蔬菜经过磨碎，115°C灭菌30min，降温至常温备用，所述蔬菜选自白菜，土豆，萝卜，胡萝卜，洋葱，菠菜，韭菜，香菜，芹菜中的一种或一种以上。7.根据权利要求1所述的采用深层液体发酵提取纳豆激酶的方法，其特征在于，所述种子罐中装填培养基，所述培养基由以下重量份数的组分组成:蛋白胨50-60份，磷酸二氢钾1-3份，硫酸钱1-5份，氯化钠1-5份，葡萄糖20-45份，硫酸镁1-2份，鹿糖10-30份，琼脂10-20份，去离子水500-800份。8.根据权利要求1所述的采用深层液体发酵提取纳豆激酶的方法，其特征在于，步骤(8)所述过滤的操作步骤为: 1)检查板框液压系统及装置，将合格滤布平整地铺在板框间； 2)启动液压栗，顶紧，压力控制在7-9Mpa; 3)将发酵液用栗输入板框，起栗时，掀开板框入料阀、回流阀，开贮罐口、栗入口，起栗; 4)过滤时，料液要始终保证温度恒定，搅拌不能停止，滤液要保证清晰透明，出料减慢时，证明滤渣已满，停止进料，罐渣吹干后将接收槽内料液排净，堵好出口，启动液压系统，退回板框，清理框内滤饼，洗好滤布，重新装好顶紧。
【专利摘要】本发明公开了一种采用深层液体发酵提取纳豆激酶的方法。该方法采用如下步骤制备纳豆激酶：菌种培养，空消，投料，实消，接菌种悬浮液，移种，放罐清洗，过滤，低温冷冻干燥，粉碎，分装，包装，储存。采用本发明的方法制备纳豆激酶，产量高，产品纯净，杂质含量低，纳豆激酶含量可大4000IU/g以上，达到了具有口服药用效果所规定的含量，也可以作为保健品长期服用该产品，该制备方法简单，流程容易控制，重复性高。CGMCC No.1127420150825
【IPC分类】C12R1/125, C12N9/56
【公开号】CN105274078
【申请号】CN201510731704
【发明人】张淑莲, 赵廷远, 陈旅平, 包选平
【申请人】张淑莲
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年11月2日