可能对途径反应具有限速影响。用于确定辅因子 的利用率的方法将是本领域技术人员已知的。
[0069] 术语"被适配成"在本文可以用于描述本发明的重组微生物的功能；例如，所述微 生物"被适配成"表达特定的酶。在关于酶的表达使用时，所述术语并不表示所述酶被连续 地表达，它意图涵盖其中所述酶可以被表达并且这样的表达可以是组成型表达或诱导型表 达的情形。
[0070] 如本文所提到的"发酵液"是至少包含营养素和微生物细胞的培养基。
[0071] 术语"提高效率"、"提高的效率"等在关于发酵途径或发酵过程使用时包括但不限 于以下各项中的至少一项：实现发酵的微生物的生长速率提高；在升高的产物浓度下生长 速率或产物产生速率提高；发酵液中发酵产物的浓度提高；每单位体积的所消耗的基质所 产生的发酵产物的体积提高；发酵产物的产生速率或产生水平提高。效率的提高是相对于 如在使用亲本微生物时所测量的相应变量来测量的。
[0072]"酶活性"、"一种或多种酶的活性"以及类似短语应当被宽泛地认为指的是酶活 性，包括但不限于单独的酶的活性、酶的量、或酶的利用率。因此，在提到"提高"酶活性的 情况下，它应当被认为包括单独的酶的活性提尚、酶的量提尚、或酶的利用率提尚以催化特 定的反应。
[0073] 短语"参与催化"意图涵盖直接催化反应（即促进或提高所述反应的速率）的酶 以及没有直接催化反应，但是促进相关酶的生物功能的辅因子。
[0074] 短语"包含一氧化碳的基质"和类似术语应当被理解为包括例如其中一氧化碳可 供一种或多种细菌菌株使用以进行生长和/或发酵的任何基质。
[0075] 短语"包含一氧化碳的气体基质"以及类似短语和术语包括含有一定水平的一氧 化碳的任何气体。在某些实施方案中，所述基质含有至少约20体积％至约100体积％的 C0、20体积％至70体积％的C0、30体积％至60体积％的C0、以及40体积％至55体积％ 的CO。在具体实施方案中，所述基质包含约25体积％、或约30体积％、或约35体积％、或 约40体积％、或约45体积％、或约50体积％的C0、或约55体积％的C0、或约60体积％的 C0〇
[0076] 虽然所述基质未必含有任何氢气，但H2的存在不应当会对根据本发明的方法的产 物形成有害。在具体实施方案中，氢气的存在使得产生醇的总效率提高。举例来说，在具体 实施方案中，所述基质可以包含约2:1、或1:1、或1:2比率的H2:C0。在一个实施方案中，所 述基质包含约30体积％或更少的H2、20体积％或更少的H2、约15体积％或更少的H2、或约 10体积％或更少的H2。在其它实施方案中，所述基质流包含低浓度的H2，例如少于5%、或 少于4 %、或少于3 %、或少于2 %、或少于1 %，或基本上不含氢气。所述基质还可以含有一 定的C02，例如像约1体积％至约80体积％的C02、或1体积％至约30体积％的C02。在一 个实施方案中，所述基质包含少于或等于约20体积％的C02。在具体实施方案中，所述基质 包含少于或等于约15体积％的0) 2、少于或等于约10体积％的0)2、少于或等于约5体积％ 的C02或基本上不含C02。
[0077] 在随后的说明中，在对"含有C0的气体基质"进行输送和发酵方面对本发明的实 施方案进行描述。然而，应当了解的是，所述气体基质可以替代的形式提供。举例来说， 所述含有C0的气体基质可以溶解于液体中的形式提供。基本上，使用含有一氧化碳的气 体使液体饱和，然后将该液体添加到生物反应器中。这可以使用标准方法来实现。举例来 说，可以使用微泡分散发生器（Hensirisak等，用于需氧发酵的微泡分散发生器的按比例 放大（Scale-upofmicrobubbledispersiongeneratorforaerobicfermentation)； AppliedBiochemistryandBiotechnology,第 101 卷，第 3 期 /2002 年 10 月）。再举例 来说，可以使所述含有C0的气体基质吸附到固体载体上。这些替代方法由术语"含有C0的 基质"等的使用所涵盖。
[0078] 在本发明的具体实施方案中，所述含C0的气体基质是工业尾气或废气。"工业废 气或尾气"应当被宽泛地认为包括由工业过程产生的任何包含C0的气体并且包括由于铁金 属产品制造、非铁产品制造、石油炼制过程、煤的气化、生物质的气化、电力生产、炭黑生产 以及焦炭制造所产生的气体。另外的实例可能提供于本文其它地方。
[0079] 除非上下文另有要求，否则如本文所用的短语"发酵"、"发酵过程"或"发酵反应" 等意图涵盖所述过程的生长阶段和产物生物合成阶段这两者。如还将在本文所描述，在一 些实施方案中，所述生物反应器可以包括第一生长反应器和第二发酵反应器。因而，向发酵 反应物中添加金属或组合物应当被理解为包括向这些反应器中的任一个或这两个中添加。
[0080] 术语"生物反应器"包括由一个或多个容器和/或塔或管道布置组成的发酵装置， 它包括连续搅拌釜式反应器（CSTR)、固定化细胞反应器（ICR)、滴流床反应器（TBR)、鼓泡 塔、气升式发酵罐、静态混合器、或适用于气-液接触的其它容器或其它装置。在一些实施 方案中，所述生物反应器可以包括第一生长反应器和第二发酵反应器。因而，在提到向生物 反应器或发酵反应物中添加基质时，在适当时应当被理解为包括向这些反应器中的任一个 或这两个中添加。
[0081] 如本文所提到的"穿梭微生物"是表达甲基转移酶并且不同于目的微生物的微生 物。
[0082] 如本文所提到的"目的微生物"是表达被包括在表达构建体/载体上的基因并且 不同于穿梭微生物的微生物。
[0083]"外源性核酸"是如下的核酸，所述核酸源于它们被引入的微生物的外部。外源性 核酸可以来源于任何适当的来源，包括但不限于它们欲被引入的微生物（例如在产生重组 微生物的亲本微生物中）、不同于它们要被引入的生物体的微生物的菌株或菌种，或者它 们可以人工或重组方式形成。在一个实施方案中，所述外源性核酸表示在它们欲被引入的 微生物内天然存在的核酸序列，并且它们被引入以提高特定基因的表达或过表达特定基因 (例如通过增加所述序列（例如基因）的拷贝数，或引入强启动子或组成型启动子以提高表 达）。在另一个实施方案中，所述外源性核酸表示在它们欲被引入的微生物内并非天然存在 的核酸序列并且允许在所述微生物内并非天然存在的产物表达或提高所述微生物原生的 基因的表达（例如在引入诸如启动子之类的调节元件的情况下）。所述外源性核酸可以被 适配成整合到它欲被引入的微生物的基因组中或保持在染色体外的状态。
[0084]"外源性"也可以被用于指蛋白质。这指的是在产生重组微生物的亲本微生物中不 存在的蛋白质。
[0085] 如本文关于重组微生物和核酸或蛋白质所用的术语"内源性"指的是产生重组微 生物的亲本微生物中存在的任何核酸或蛋白质。
[0086] 氧化还原酶（或脱氢酶、氧化酶）包括催化电子从一种分子，即还原剂（也被称为 电子供体）转移到另一种分子，即氧化剂（也被称为电子受体）的酶。氧化还原酶在酶的EC号分类中被分类为EC1。
[0087] 应当了解的是，本发明可以使用如下的核酸来实施，所述核酸的序列不同于本文 所具体举例说明的序列，前体条件是它们发挥基本上相同的功能。对于编码蛋白质或肽的 核酸序列来说，这意味着所编码的蛋白质或肽具有基本上相同的功能。对于表示启动子序 列的核酸序列，变体序列将能够促进一种或多种基因表达。这些核酸在本文可以被称为"功 能上等同的变体"。举例来说，核酸的功能上等同的变体包括等位基因变体、基因片段、包括 突变（缺失、插入、核苷酸取代等）和/或多态性的基因等。来自其它微生物的同源基因也 可以被认为是本文所具体举例说明的序列的功能上等同的变体的实例。这些包括诸如丙 酮丁醇梭菌（Clostridiumacetobutylicum)、拜氏梭菌（Clostridiumbeijerinckii)、杨 氏梭菌（C.ljungdahli)之类的菌种中的同源基因，关于这些基因的详情可在诸如基因库 (Genbank)或NCBI等网站上公开获得。短语"功能上等同的变体"还应当被认为包括序列 由于针对特定的生物体进行密码子优化而发生改变的核酸。本文的核酸的"功能上等同的 变体"优选地将与所鉴定出的核酸具有至少约70 %，优选地约80 %，更优选地约85 %，优选 地约90%，优选地约95%或更大的核酸序列同一性。
[0088] 还应当了解的是，本发明可以使用如下的多肽来实施，所述多肽的序列不同于本 文所具体提到或举例说明的多肽的氨基酸序列。这些变体在本文可以被称为"功能上等同 的变体"。蛋白质或肽的功能上等同的变体包括与所鉴定出的蛋白质或肽共有至少40%，优 选地50 %，优选地60 %，优选地70 %，优选地75 %，优选地80 %，优选地85 %，优选地90 %， 优选地95%或更大的氨基酸同一性的那些蛋白质或肽并且与所关注的肽或蛋白质具有基 本上相同的功能。这些变体在它们的范围内包括蛋白质或肽的片段，其中所述片段包含多 肽的截短形式，在所述截短形式中，缺失可以是1至5个、1至10个、1至15个、1至20个、 1至25个氨基酸，并且可以在多肽的任何一个末端处从残基1延伸到残基25,并且其中缺 失可以具有所述范围内的任何长度；或可以位于内部位置。本文的特定多肽的功能上等同 的变体还应当被认为包括由例如如前一段落中所举例说明的其它细菌菌种中的同源基因 表达的多肽。
[0089] 如本文所用的"基本上相同的功能"意图意指作为变体的核酸或多肽能够发挥产 生它的核酸或多肽的功能。举例来说，本发明的酶的变体将能够与该酶催化相同的反应。然 而，它不应当被认为意指所述变体与产生所述变体的多肽或核酸具有相同的活性水平。
[0090] 可以使用本领域技术人员已知的方法来评估功能上等同的变体与产生所述变体 的核酸或多肽是否具有基本上相同的功能。然而，举例来说，测试氢化酶、甲酸脱氢酶或亚 甲基-THF脱氢酶活性的测定描述于Huang等（2012)中。
[0091] "过表达（over-express) "、"过表达（overexpression) "以及类似术语和短语在 关于本发明使用时应当被宽泛地认为包括在相同条件下一种或多种蛋白质的表达（包括 编码其的一种或多种核酸的表达）与亲本微生物的所述蛋白质（包括核酸）的表达水平相 比的任何提高。它不应当被认为意指所述蛋白质（或核酸）以任何特定的水平表达。
[0092] "重组微生物"是在与亲本微生物相比时已经经受有意的遗传修饰的微生物。"遗 传修饰"应当被宽泛地理解并且包括例如核酸的插入、缺失或取代。
[0093] "亲本微生物"是用于产生本发明的重组微生物的微生物。亲本微生物可以是在 自然界中存在的微生物（即野生型微生物）或先前已经经过修饰的微生物（即它是重组微 生物）。本发明的重组微生物可以被修饰以表达或过表达在亲本微生物中没有表达或没有 过表达到所需水平的一种或多种酶，或可以被修饰以表现出一种或多种辅因子的利用率提 尚。
[0094] 术语核酸"构建体"或"载体"和类似术语应当被宽泛地认为包括适于用作运载体 将遗传物质转移到细胞中的任何核酸（包括DNA和RNA)。所述术语应当被认为包括质粒、 病毒（包括噬菌体）、粘粒以及人工染色体。构建体或载体可以包括一种或多种调节元件、 复制起点、多克隆位点和/或选择标记。在一个具体的实施方案中，构建体或载体被适配成 允许由所述构建体或载体编码的一种或多种基因表达。核酸构建体或载体包括裸核酸，以 及使用一种或多种试剂配制以促进向细胞中的递送的核酸（例如与脂质体缀合的核酸、含 有所述核酸的生物体）。所述载体可以用于克隆或表达核酸以及用于使微生物转化以产生 重组微生物。
[0095] 发酵途径的效率可以通过提高通过所述途径的反应通量来提高。通量提高会引起 以下各项中的一项或多项：实现发酵的微生物的生长速率提高；在升高的产物浓度下生长 速率和/或产物产生速率提高；发酵液中发酵产物的浓度提高；每单位体积的所消耗的基 质所产生的发酵产物的体积提高；发酵产物的产生速率或产生水平提高。优选地，效率提高 使得发酵产物的产生速率提高。
[0096] 本申请的发明人已经证实了鉴定发酵途径中的限速途径反应的方法，其中特定的 途径反应影响通过所述整个途径的通量。在一些情况下，这些限速途径反应没有进行到它 们的最大限度并且可能期望提高它们单独的速率。如本文所述的本发明使得能够鉴定发酵 途径中的限速途径反应（即瓶颈）以及使用策略来提高参与所述限速途径反应的酶的活性 和/或辅因子的利用率。本发明因此有助于鉴定所述瓶颈以及调整所述限速途径反应的速 率以对通过所述途径的反应通量具有随之而来的影响。这是首次鉴定出限速途径反应并且 使用重组一氧化碳营养型微生物来解决。
[0097] 鉴定限速反应（瓶颈）的一种方法在于测量涉及从基质到产物的发酵途径的所有 反应的酶活性。这可以通过分析在工艺条件下生长的细胞中的反应的酶活性以鉴定出具有 最低速率的反应来进行。然后可以对这些反应进行调整以使得它们不具有限速性，从而提 高整个系统中的通量。这种途径分析和瓶颈去除还从未在梭菌属菌种中被实施过。
[0098] 本文所述的方法和重组微生物使得能够对另外的生物化学途径进行研究并且产 生理想的发酵产物。所述方法对于其中亲本微生物中的产物收率可能没有达到欲作为可行 目标的产物收率或所述收率低到不可检出的途径具有特别的效用。
[0099] 本发明提供了一种产生发酵产物的方法，所述方法至少包括以下步骤：
[0100] a)确定发酵途径中的限速途径反应；
[0101]b)鉴定参与催化所述限速途径反应的一种或多种酶、辅因子或这两者；
[0102] c)使用重组一氧化碳营养型梭菌属微生物使包含C0的基质发酵，所述微生物被 适配成在与亲本微生物相比时表现出以下各项中的至少一项：i)b)的一种或多种酶或其 任何一种或多种的功能上等同的变体的活性提高；或ii)b)的一种或多种辅因子的利用率 提尚，以广生发酵广物。
[0103] 本发明还提供了一种提高通过发酵途径的通量的方法，所述方法至少包括以下步 骤：
[0104] a)确定所述发酵途径中的限速途径反应；
[0105] b)鉴定参与催化所述限速途径反应的一种或多种酶、辅因子或这两者；
[0106]c)使用重组一氧化碳营养型梭菌属微生物使包含C0的基质发酵，所述微生物被 适配成在与亲本微生物相比时表现出以下各项中的至少一项：i)b)的一种或多种酶或其 任何一种或多种的功能上等同的变体的活性提高；或ii)b)的一种或多种辅因子的利用率 提尚。
[0107] 本申请的发明人已经分析了参与发酵途径的酶的活性并且发现一些途径反应与 同一途径中的其它反应相比表现出显著更低的酶活性。这表明所述途径反应限制了通过发 酵途径的总通量并且提供了一种鉴定限速途径反应的方法。
[0108] 可以通过本领域技术人员已知的方法来测量酶活性。在一个具体的实施方案中， 酶活性是通过Huang等（2012)中所述的方法来测量的并且在实施例1中被提到。
[0109] 适合进行酶活性分析的发酵途径的实例包括伍德-扬达尔途径；产生乙醇、 2, 3-丁二醇或其前体，如乙酰辅酶A和丙酮酸盐的发酵途径；以及在发酵途径中可能需要 的辅因子四氢叶酸盐和钴胺素（B12)的生物合成途径。
[0110] 伍德-扬达尔途径由许多由如图1和图2中所述的酶催化的反应构成。在伍德-扬 达尔途径之后使得理想的发酵产物产生的步骤也被认为是发酵途径的一部分。
[0111] 在一个具体的实施方案中，所述发酵途径使得选自由以下各项组成的组的发酵产 物产生：乙醇、丁醇、丙酮、异丙醇、异丁醇、2, 3- 丁二醇、丁二酸盐、类异戊二烯、脂肪酸、以 及生物聚合物。
[0112] 在一个实施方案中，为了确定所述途径反应中的一种或多种是否限制了通过发酵 途径的通量率，对催化至少两种或更多种单独的途径反应的酶的酶活性进行比较。如果在 比较时发现一种或多种酶与同一反应途径中的其它酶相比表现出更小的活性，那么这表明 所述反应没有进行到最大限度。在一个具体的实施方案中，所述酶的活性比所述途径中其 它酶的活性小了 5%、10%或20%。在一个具体的实施方案中，所述活性小了 69%。在另一 个实施方案中，所述活性小了 86 %。在另一个实施方案中，所述活性小了 90 %，或活性的差 异大于90%。
[0113] 因而，在一个具体的实施方案中，通过分析构成发酵途径的两种或更多种途径反 应的酶活性，然后将具有更低的/最低的活性的酶指定为限速途径反应来确定限速途径反 应。
[0114] 酶活性的缺乏可能由许多因素所引起，包括：缺乏游离酶来催化反应；竞争性基 质对酶的抑制或使酶失活；缺乏辅因子来促进反应或缺乏酶底物。
[0115] 本发明还提供了解决限速途径反应的问题的方法。限速途径反应中酶活性的不足 可以通过提供重组梭菌属微生物来解决，所述微生物被适配成表现出以下各项中的至少一 项：i)参与所述限速途径反应的酶或其功能上等同的变体的活性提高；或ii)参与所述限 速途径反应的辅因子的利用率提高。这使得通过所述途径的通量总体提高。
[0116] 因此，本发明提供了一种产生重组一氧化碳营养型梭菌属微生物的方法，所述微 生物被适配成相对于亲本微生物表现出提高的通过发酵途径的通量，所述方法包括：
[0117] a)确定所述发酵途径中的限速途径反应；
[0118]b)鉴定参与催化所述限速途径反应的一种或多种酶、辅因子或这两者；
[0119]c)使亲本微生物转化以产生重组微生物，所述重组微生物被适配成在与亲本微生 物相比时表现出以下各项中的至少一项：i)b)的一种或多种酶或其任何一种或多种的功 能上等同的变体的活性提尚；或ii)b)的一种或多种辅因子的利用率提尚；
[0120] 其中所述发酵途径能够由包含C0的基质产生一种或多种发酵产物。
[0121 ] 在本发明的一个具体的实施方案中，所述重组微生物被适配成进行以下各项中的 至少一项：
[0122] i)过表达参与催化限速途径反应的一种或多种酶或其任何一种或多种的功能上 等同的变体；
[0123]ii)表达参与催化限速途径反应的一种或多种外源性酶或其任何一种或多种的功 能上等同的变体；或
[0124]iii)具有参与催化限速途径反应的一种或多种辅因子的提高的利用率。
[0125] 以这种方式，本申请的发明人已经证实一种以如下的方式克服以下各项中的至少 一项的方法：i)酶活性低或缺乏；或ii)辅因子的利用率低或缺乏，所述方式提高通过发酵 途径的通量并且最终提高发酵的效率。
[0126] 在本发明的一个具体的实施方案中，所述一种或多种酶选自由以下各项组成的 组：醇脱氢酶（EC1. 1. 1. 1)、醛脱氢酶（酰化）（EC1