一种锰氧化假单胞菌t34及生物氧化锰制备方法和降解环丙沙星的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及应用微生物技术领域W及环境修复领域，具体涉及一株可W生成儘氧 化物的假单胞菌T34,同时涉及该细菌-儘氧化物制备方法W及该菌在降解环丙沙星方面 的应用。
【背景技术】：
[0002] 儘氧化物通过吸附、催化和氧化作用对环境中污染物和营养元素的迁移转化产重 要影响。从而在重金属元素和有机碳的生物地球化学循环过程中起着非常重要的作用。儘 氧化物对多种金属离子具有吸附能力和很强的氧化能力，在厌氧环境中还可W作为细胞呼 吸作用过程的临时电子受体，氧化H2电子受体。环境中的大部分儘氧化都是来自微生物 的，要么是微生物氧化过程的直接产物，要么是生物氧化儘初级产物在自然条件下老化产 生的。
[0003] 生物氧化儘一般都是结晶弱或短程有序的纳米级矿物，具有较高的比表面积和反 应活性。在W往的研究中，对于儘氧化物性质和结构特点的认识主要是基于对化学合成儘 氧化物的研究结果，化学合成儘氧化物都是在极端抑、Μη离子浓度和温度条件下形成的。 而送些极端条件并不是自然环境下普遍存在的，研究生物氧化儘的生物形成过程及其生物 化学机制、生物氧化儘的结构特点W及与重金属离子之间的相互作用机制、对于理解生物 氧化儘在重金属元素生物地球化学循环中的作用有着非常重要的意义；将儘氧化菌及生物 氧化儘作为重金属污染的原位修复材料也有很好的应用前景、本研究主要探讨微生物形成 儘氧化物的机制、生物氧化儘的性质W及与环丙沙星相互作用机制等
[0004] 哇诺丽类抗生素作为一种广谱廉价的抗菌药而广泛应用于人类和动物疾病的治 疗及预防，或者被用作禽畜的生长促进剂。由于其大量广泛使用，近年来许多研究证实哇诺 丽类药物广泛存在于环境介质中，并可能由此一定程度上改变±壤、水环境微生物结构，导 致细菌抗药性增强、抗病菌种的出现，对生态系统安全和人类健康形成潜在的风险。因此， 客观的评价哇诺丽类抗生素对生态系统和人体健康的潜在风险，了解它们在环境中的命运 非常重要。作为抗生素类化合物，哇诺丽类药物相当抵制由微生物引起的生物降解，而吸附 到±壤、沉积物或者溶解的有机物是哇诺丽类药物的一个重要的赋存状态
[0005] 儘氧化物是±壤、沉积物和湖泊、海洋等自然环境中的常见矿物组分，具有较大的 表面积和较高的氧化还原电势，是环境中活性较高的反应体系之一。大量研究表明Μη化对 进入环境中的多种污染物，如酪类、苯胺等具有降解作用。针对送一特性，本发明选取哇诺 丽类抗生素中正在广泛使用的环丙沙星为对象，研究其在二氧化儘氧化作用下的非生物氧 化转化反应的动力学，
[0006] 氣哇睹丽是一类广泛使用的广谱型抗菌剂，大量用于人和动物的疾病治疗.该类 化合物的分子中除了共同的哇诺丽结构外，脈嗦环也是很重要的结构.随着脈嗦环原子的 化学环境不同，表现出不同的氧化还原反应特征。
[0007]Mn〇2对氣哇诺丽的转化反应主要发生在脈嗦环上，首先生成表面配合物，一个电 子从氣哇诺丽分子转移到Mn4+，生成氣哇诺丽自由基中间体，Mn3+被进一步还原成Mn2+.形 成的自由基中间体中N原子上的电子可与苯环中电子共振，再经偶合、居基化、脱烷基等反 应生成一系列产物.由于芳香环对N原子的空间位阻效应，经路径1偶合的产物比例很小； 相比而言，经路径3脱烷基后的偶合产物更易形成。在路径2的居基化作用中，N1原子的 激发态转移一个电子给Mn3+生成亚胺离子，Μ经过与N1相似的双电子转移过程，形成另 一个亚胺离子（己二胺），二亚胺离子迅速水解为二醇，进而氧化为二元醒或一元醒.路 径3的Ν-脱烷基化与路径2相似，首先形成亚胺离子并立即水解；尽管相连于芳香环的亚 胺离子水解相对较慢，而Ν4原子上发生的氧化反应与水解反应间仍存在竞争，生成部分 脱烷基化产物（Μ-26).相类似，靠近芳香环的Ν1被氧化为相应的亚胺离子，并最终水解 为完全脱烷基产物（Μ-69).过量二氧化儘存在时，此产物会W类似苯胺氧化的方式，随着 反应时间的延长有所减少.基于之前讨论脈嗦环Ν原子的反应性及空间位阻效应，（Μ-69) 与Μη化的反应活性较低，更易发生类似苯的禪合反应。
[0008]Ν1原子上的电子转移过程是反应的决速步，由于表面配合物的形成在决速步之 前，因此配合物的生成速率可能影响总反应的速率.pH由高变低时，氣哇诺丽分子发生从 阴离子、中性分子、到阳离子形态的转化，由于Mn〇2带负电荷，其吸附作用增强，更易形 成配合物，总反应速率加快。同样，若分子中引入吸电子取代基将降低电子转移速率，进 而降低总反应速率。
[0009] 利用儘氧化菌去除水体抗生素污染，可降低成本、避免二次污染且除儘效率高。在 我国大部分地区抗生素污染状况很严峻，尤其是湖泊和河流较多的南方。建立针对水环境 的抗生素治理方案对环境治理有积极意义。此外，儘氧化菌体及其生物儘氧化物复合体具 有精巧的结构，W此为框架对其进行改性制备新的环境材料也是一个新的、有前景的研究 课题。
【发明内容】
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[0010] 本发明的目的在于提供了一种可W生成儘氧化物且易于培养的假单胞菌株T34。 该菌株可W在细菌表面生成二氧化儘包被，跟其他儘氧化菌株相比，该菌株生成儘氧化物 能力强，易于培养及保存，在环境修复中展现了巨大潜力。该菌已于2014年4月28号送 往中国典型培养物保藏中必保藏，分类命名；假单胞菌PseudomonasSP.T34,保藏编号： CCTCCNO:M2014168 ;地址；中国武汉武汉大学。
[0011] 本发明的另一个目的在于提供了一种获得生物氧化儘的方法。该方法利用假单胞 菌T34自身的强氧化能力，在其生长过程中加入二价儘离子，该菌可将环境中的低价儘离 子氧化，并且W二氧化儘的形态固定在细菌表面。二氧化儘性能丰富，具有吸附、降解等功 能，是科学研究中经常用到的材料。相比于化学合成二氧化儘，该方法简单易行，生成效率 高，并且性能稳定，具有极大的产业推广前景。
[0012] 本发明还有一个目的在于提供了一种儘氧化假单胞菌T34在降解抗生素中的应 用。利用生物氧化儘降解环境中残留的抗生素药物环丙沙星，该方法成本低廉，生物氧化儘 易于制得，降解效率高并且对环境亲和。该方法省去了利用二氧化儘降解抗生素过程中繁 琐复杂的人工合成二氧化儘的步骤，也大大提高了二氧化儘降解环丙沙星的效率。
[0013] 为了实现上述目的，本发明采用W下技术措施：
[0014] 一株儘氧化菌株T34,按照W下步骤得到：
[001引1.称取Ig铁儘矿（湖南要阳）样品，加入到一个盛有9血并装有玻璃珠的无菌水Η角瓶中，在2(K)r/min，3(rC条件下往复震荡30min，摇散菌体；
[0016] 2.制成10 1稀释度的菌悬液，静置lOmin后取上清液梯度稀释得到如下Η个稀释 度；104、105、106，分别取H个稀释度的0.1mL稀释液涂布牛肉膏蛋白腺培养基（见表l)， 每个稀释度分别涂Η个平板；
[0017] 3.平板倒置于3(TC恒温箱中，培养24~4化后观察并计数。同时挑取优势生长 细菌，进行划线分离与纯化，并且镜检观察所分离细菌的基本形态；
[0018] 4.另外分离纯化得到的细菌一份用40%甘油按1:1保存于-8(TC备用，一份用 于儘氧化活性的测定。分离得到的儘氧化活性最高的为已经在中国典型培养物保藏中必 保藏，保藏日期：2014年4月28号，分类命名；假单胞菌Pseudomonassp.T34,保藏编号： CCTCCN0:M2014168 ;地址；中国武汉武汉大学。
[0019] 该菌为假单胞菌，是一株好氧菌，革兰氏染色反应显示其为革兰氏阴性菌，形态呈 短杆状。通过X射线衍射狂畑）显示，该菌细胞表面形成的儘氧化物结构为δ-Μη化。
[0020] 对假单胞菌Pseudomonassp.Τ34中负责调控儘氧化物形成的基因进行序列分析。 挑取单菌落接种于Lept培养基，提纯基因组DNA(提纯方法参见分子克隆技术）。然后W leSrRNA基因序列为模板扩增leSrRNA基因序列（SEQIDNO. 1所示），将该序列与数据库 对比，确定该菌株为假单胞菌属。
[0021] 一种生物氧化儘的制备方法，具体如下：
[002引A.从斜面上挑取已活化的假单胞菌T34接种于含Mn2+(终浓度为Immol/L)的Lept培养基巧血）中，在3(TC摇床培养24h制备接种用的菌悬液；
[002引 B.按照接种量为1%