使用甲烷硅基化的季铵化合物(siqac)提取dna/rna的方法_3

文档序号:9583255阅读:来源:国知局
04wt%,更优选 为至少0. 06wt%。所述具有含娃官能团的季锭化合物优选为占所述与细胞或衣壳接触的组 合物的最多lOwt%,宜为最多5wt%,优选为最多Iwt%,优选为最多0. 5wt%,更优选为最 多0. %,更优选为最多0.Iwt%。
[0039] 用于本发明方法中的组合物可W基本由通式(I)的化合物组成,或可W还包括其 他成分。
[0040] 除上述溶剂外还可W包括的成分可W包括一种或多种增溶剂、缓冲剂和PCR促进 剂。
[0041] 优选地,所述组合物还包括增溶剂。
[0042] 适合的增溶剂包括任何提高具有含娃官能团的季锭化合物的溶解度,特别是在水 中的溶解度的化合物。
[0043] 适合的增溶剂的例子包括非离子表面活性剂。非离子表面活性剂可W具有亲水部 分,宜为烷氧基部分或糖部分。合适的非离子表面活性剂包括醇乙氧基化物和脂肪醇聚巧。 本发明中宜为使用的非离子表面活性剂的亲水-亲油平衡(HLB)值至少为7,优选至少为 10。特别合适的非离子表面活性剂的HLB值范围可W在10~16,最好是10-14。对于所 述限定的目的,使用Griffin经典方法来测定HLB值(GriffinWC:"CalculationofHLB ValuesofNon-IonicSurfactants,"JournaloftheSocietyofCosmeticChemists 5(1954) :249) 〇
[0044] 本申请适用的增溶剂包括控基糖类化合物。此述控基糖类化合物指的是包含控基 和糖类部分的化合物。
[0045] 所述控基可W通过碳碳键或碳氧键与糖类部分结合。优选地,其通过碳氧键与糖 类部分结合,例如通过醋键或酸键。最优选地,它通过酸键与寡糖部分结合。因此,在优选 实施例中,所述增溶剂为糖类部分的控基酸。
[0046] 所述控基糖类化合物可W包含一个或多个控基。优选地,它包含一个控基。所述 控基可w是任意取代的烷基、締基或烘基。最优选地,它是任意取代的烷基。合适的取代基 包括面素,径基,硝基,琉基,氨基,烷基,烷氧基,芳基,横基和硫氧基。任何取代基可W在链 内或沿链取代,例如所述链可W包括酸键。
[0047] 优选地,所述控基是未取代烷基,它可W是直链或支链。最优选地,它是直链。尤 为优选的控基为具有1-30个碳原子的烷基,优选为2-24个碳原子,更优选为4-20个碳原 子,宜为4-16个碳原子,优选为6-14个碳原子,例如6-12个碳原子,且更优选为8-10个碳 原子。优选为具有6-12个碳原子的直链烷基。
[0048] 控基寡糖种类的糖类部分可W包含1-10个单糖种类。因此,它可W是单糖单元、 二糖单元或寡糖单元。优选地,该糖类部分包含2-8个单糖单元,宜为2-6个,优选为2-5 个,例如3或4个单糖单元。可W包含任何合适的单糖单元。优选的糖类包括阿洛糖,阿卓 糖,葡萄糖,甘露糖,古洛糖,艾杜糖,半乳糖和塔罗糖。
[0049] 该糖类部分中可W包含两种或更多种单糖的混合物。优选地,该糖类单元包含葡 萄糖。更优选地,糖类部分中包含的所有单糖单元均为葡萄糖。
[0050]在一个优选实施例中,所述增溶剂为烷基多糖巧(APG),优选为单烷基-多糖巧。 所述增溶剂宜为如通式(III)所示的化合物:
[0051]
[0052] 其中η= 5~12,优选为6~10,更优选为7~9,且m= 1~6,优选为2~5,更 优选为3或4。
[0053] 所述与细胞或衣壳接触的组合物包含增溶剂的含量宜为至少0.0 Olwt%,优选为 0.0 lwt%,更优选为至少0. 04wt%,更优选为至少0. 06wt%。
[0054] 所述与细胞或衣壳接触的组合物包含增溶剂的含量宜为占该组合物最多lOwt%, 宜为最多5wt%,优选为最多Iwt%,优选为最多0. 5wt%,更优选为最多0. %,且更优选 为 0.Iwt%。
[0055] 包含含娃官能团的季锭化合物与增溶剂的重量比优选为1:10至10:1,优选为1:5 至5:1,优选为1:3至3:1,宜为1:2. 5至2. 5:1。
[0056] 在一些实施例中,包含含娃官能团的季锭化合物与增溶剂的重量比为1:2至2:1, 优选为1:1. 5至1.5:1,更优选为1:1. 2至1.2:1。
[0057] 在一些实施例中,包含含娃官能团的季锭化合物与增溶剂的重量比为4:1至1:1, 优选为3:1至1.5:1,更优选为2. 2:1至1.8:1。
[0058] 该组合物可包含缓冲剂。任何合适的缓冲剂都可W使用。优选的缓冲剂是生物 学上可接受的缓冲剂。合适的缓冲剂的实例包括但不限于:N-(2-乙酷氨基)-氨基乙烧横 酸,乙酸,N-(2-乙酷胺基)亚氨基二乙酸,2-氨基乙横酸,氨,2-氨基-2-甲基-1-丙醇, 2-氨基-2-甲基-1, 3-丙二醇,N-(l, 1-二甲基-2-径乙基)-3-氨基-2-径基丙横酸,N, N-二-(2-径乙基)-2-氨基乙横酸,碳酸氨钢,N,Ν' -双(2-径乙基)-甘氨酸,[双-(2-径 乙基)亚氨基]-^-(径基甲基甲烧),1,3-双[Ξ(径甲基)-甲基氨基]丙烷,棚酸, 二甲基次肿酸,3-(环己基氨基)-丙横酸,3-(环己基氨基)-2-径基-1-丙横酸,碳酸钢, 环己基氨基乙横酸酸,巧樣酸,3-阳-双(径乙基)氨基]-2-径基丙横酸,甲酸盐,甘氨酸, 甘氨酷甘氨酸,N-(2-径乙基)-赃嗦-Ν' -乙横酸,N-(2-径乙基)-赃嗦-Ν' -3-丙横酸, Ν- (2-径乙基)-赃嗦-Ν' -2-径基丙横酸,咪挫,苹果酸盐,马来酸盐,2- (Ν-吗嘟代)乙横 酸,3- (Ν-吗嘟代)-丙横酸,3- (Ν-吗嘟代)-2-径基丙横酸,憐酸,赃嗦-Ν,Ν' -双(2-乙 横酸),赃嗦-Ν,Ν' -双(2-径基丙横酸),化晚,班巧酸盐,3-{[^(径甲基)-甲基]-氨 基}-丙横酸,3-阳-Ξ(径甲基)-甲基氨基]-2-径基丙横酸,2-氨基乙横酸,Ξ乙醇胺, 2-[Ξ(径甲基)-甲基氨基]-乙横酸,Ν-[Ξ(径甲基)-甲基]甘氨酸,Ξ(径甲基)-氨 基甲烧,一种特别优选的缓冲剂是Ξ(径甲基)-氨基甲烧(TRI巧。
[0059] 用于接触的组合物的抑优选为6. 5至8. 5,更优选为7至8。
[0060] 缓冲剂浓度的选择,宜为保持期望的抑。
[0061] 在一些实施例中,本发明的方法中所述与细胞或衣壳接触的组合物包含PCR促进 剂。PCR促进剂可W提高期望的PCR产物的产出,或降低不期望产物的产出。合适的PCR促 进剂的例子为本领域技术人员所知,且包括甜菜碱,DMS0,甲酯胺,牛血清白蛋白度SA),明 胶,非离子型去污剂(例如吐温⑥-20、ΝΡ-40、Triton?Χ-100),锭离子,甘油,聚乙二醇,四甲 基锭盐和二价金属离子。在优选实施例中,所述PCR促进剂促进剂包含二价金属。优选地, 所述PCR促进剂包括Mg2+离子,优选为其水盐。最优选地,所述PCR促进剂为氯化儀。
[0062] 所述与细胞或衣壳接触的组合物包含的PCR促进剂浓度优选为至少0.Olmmol,优 选为至少0. 〇5mmol,更优选为至少0.Immol。
[006引所述与细胞或衣壳接触的组合物包含的PCR促进剂含量可W为最多5mmol,宜为 最多Immol,优选为最多0. 5mmol,更优选为最多mmol。 W64] 本发明的第二方面中,提供W下内容的组合物: 阳0化](a)包含含娃官能团的季锭化合物;
[0066] 化)增溶剂;
[0067] (C)缓冲剂拟及,可选地, W側(d)PCR促进剂。
[0069] 对组分(a),化),(C)和(d)的优选特征及其在第二方面所述组合物中的含量,将 联系第一方面进行限定。
[0070] 本发明第一方面的方法的优点之一在于,提取的DNA和/或RNA可W无需分离或 纯化步骤便直接用于后续应用。
[0071] 本发明的第Ξ方面中,提供用于鉴定遗传材料成分的方法,所述方法包含W下步 骤:
[0072] (a)根据第一方面中所述方法,从细胞或衣壳中提取DNA和/或RNA;和 阳07引化)使用所提取的DNA和/或RNA作为模板进行聚合酶链式(PCR)。
[0074] 第Ξ方面的优选特征将联系本发明的第一方面和第二方面进行限定。 阳0巧]可W采用任何本领域已知方法来执行PCR步骤化)。合适的PCR技术包括基础PCR、反转录(RT) -PCR、热启动PCR、长PCR、定量终点PCR、定量实时PCR、快速扩增多态性 DM分析、嵌套式PCR和高保真PCR。
[0076] 步骤(b)所用的DM和/或RNA可W是任何合适形式。它可用作粗裂解物,裂解 物上清液,或分离纯化的DNA和/或RNA。在一个实施例中,通过离屯、旋转粗裂解物,令不溶 物沉淀到试管底部,从而得到上清液。离屯、时间长度和速度可W由本领域技术人员选择。
[0077]宜为对步骤(a)直接得到的混合物执行步骤化)。在一些实施例中,可W对步骤 (a)得到的混合物进行离屯、,在所述实施例中,可W将所得上清液用于步骤化)。运可W提 高DNA或RNA产出,和/或提高准确度。但是,在优选实施例中,步骤(a)和步骤化)之间 并未进行进一步纯化步骤,仍然可W得到满意结果。
[0078]本发明第Ξ方面的步骤化)中,提取的DNA和/或RNA用作PCR模板。本领域技 术人员知晓,PCR技术可用于多个目的。第Ξ方面的方法可W包含鉴定基因材料成分的方 法。步骤化)中,可W鉴定部分或全部在步骤(a)中提取的DNA
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