、凸起、褶皱、凹陷等)、菌落边缘状态(是否整齐、不规则、放射状等)。通过生物染色剂染色后进行显微镜镜检。
[0022]结果表明，分离纯化后得到的菌株G04菌落:菌落直径3_4mm，菌落颜色为浅乳白色，菌落半透明，菌落表面湿润、微凸起，菌落边缘整齐。镜检结果菌体为杆状，革兰氏阴性，无芽孢。
[0023]2.16s rDNA序列同源性分离
常规方法培养上述步骤分离纯化得到的菌株G04，提取菌株的总DNA作为基因扩增模板，以细菌 16s rDNA 通用引物，27F: 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3
1492R:5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3在PCR扩增仪上进行PCR反应。反应完成后，取2ulPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。确认PCR扩增片段。PCR产物用AxyPr印DNA凝胶回收试剂盒回收，具体操作按试剂盒说明书进行。取各个菌种纯化后的PCR产物，使用测序仪ABI3730-XL进行DNA测序。与NCBI GenBank中的已知序列进行同源性比较后，判定细菌种类，将细菌划分到属或种。
[0024]PCR基因扩增得到菌株G04的16s rDNA基因片段约1.3kb，测定序列后与NCBI数据库中已公开的16s rDNA序列进行在线同源性比较，结果显示G04与中华根瘤菌属Sinorhizobium sp.的同源性最高，达到99%。
[0025]菌株G04的16s rDNA序列相见序列表中的序列1。
[0026]3.生理生化特征分析
参考《伯杰氏细菌鉴定手册》(R.E.布坎南，N.E.吉本斯.伯杰氏细菌鉴定手册(第八版).科学出版社，1984.)测定上述菌株G04的生理生化特征。
[0027]所述菌株G04的生理生化特征测定结果如下:
生长温度:4°C不生长，28°C生长，37°C不生长； 耐盐性实验:0.5% NaCl生长，1% NaCl生长，2% NaCl不生长；
糖发酵实验:葡萄糖阳性，蔗糖阳性，甘露醇阳性，乳糖阳性，纤维素阴性；
水解淀粉实验:阴性；
利用柠檬酸盐:阳性；
水解酪蛋白:阴性；
接触酶反应:阳性；
氧化酶反应:阳性。
[0028]4.生长特性分析
进行了菌株G04最适pH生长实验。采用阿须贝培养基，以5%接种量接种后调整pH值，分别测定G04在pH4、pH5、pH6、pH7、pH8条件下培养72h后的活菌数量。
[0029]结果表明，G04在pH7_8的培养条件下单位菌液中的活菌数量最高，达到8.6cfu/ml，最适生长pH为pH7_8。
[0030]鉴于上述形态、16s rDNA序列同源性分析、生理生化特征分析结果，将实施例1中分离纯化得到的居住G04鉴定为细菌域中华根瘤菌属(Sinorhizobium sp.)。该中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.) G04已于2015年9月14日保藏与中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC N0.11376ο
[0031]
实施例2、中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.) G04 CGMCC N0.11376的固氮酶活性测试对实施例1分离纯化得到的中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)G04 CGMCC N0.11376进行固氮酶活性测试，采用乙炔还原法，具体方法如下所述:制备获得G04菌株的悬浮液(细胞，lX10sml 3，取lml接种于盛有5ml半固体阿须贝培养基的血清瓶中，28°C下培养48h。将血清瓶瓶盖换成橡胶塞，并用无菌注射器抽出10%的气体，然后注入10%乙炔，再在28°C下培养36h。用无菌注射器从血清瓶中抽取混合气体0.2ml注入气相色谱仪，测定乙烯生成量，根据以下公式计算固氮酶活性。N=hxCV/(24.9hst)。其中N为固氮酶活性，即产生乙炔的浓度(C2H2，nmol h 1 ml hx为样品峰值，C为标准乙稀浓度(nmol ml V为培养容器体积(ml)，24.9为常数，hs为标准乙烯峰值，t为样品培养时间(h)。以固氮培养基培养圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum) 1.178，以同样的方法测定其固氮酶活性作为参照。以上实验均设三组重复。
[0032]结果显示，实施例1中分离纯化得到的中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.) G04CGMCC N0.11376的固氮酶活性为208.14 (C2H2，nmol h 1 ml 3，而圆褐固氮菌1.178的固氮酶活性仅为124.60 (C2H2, nmol h1 ml 3。这一结果表明，本发明的中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)G04 CGMCC N0.11376具有比传统生物固氮肥料中所使用的菌株圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum) 1.178更高的固氮能力，在拌种剂、育苗接种剂、固氮微生物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前景。
【主权项】
1.中华根瘤菌(Sinorhizobiumsp.)G04，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC N0.11376。2.权利要求1所述的中华根瘤菌(Sinorhizobiumsp.) G04的用于制备菌剂。3.权利要求1所述的中华根瘤菌(Sinorhizobiumsp.) G04用于制备拌种剂。4.权利要求1所述的中华根瘤菌(Sinorhizobiumsp.) G04用于制备生物有机肥。5.权利要求1所述的中华根瘤菌(Sinorhizobiumsp.) G04用于制备育苗接种剂。6.权利要求1所述的中华根瘤菌(Sinorhizobiumsp.) G04用于制备叶面喷施剂。7.权利要求2所述中华根瘤菌(Sinorhizobiumsp.)G04的用途所述的菌剂为下述I)-5)任一的菌剂: 1)用于固氮的菌剂； 2)产生固氮酶的菌剂； 3)促进植物生长的菌剂； 4)改良培肥土壤的菌剂； 5)提高植物抗逆性的菌剂。
【专利摘要】本发明公开了一株中华根瘤菌及其用途。该中华根瘤菌（Sinorhizobium？sp.）GO4在中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC？No.11376。本发明提供的中华根瘤菌（Sinorhizobium？sp.）GO4？CGMCC？No.11376具有较高的固氮酶活性，在农作物拌种剂、育苗接种剂、固氮微生物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前景。CGMCC No.1137620150914
【IPC分类】C12N1/20, C05F11/08, C12R1/01
【公开号】CN105349456
【申请号】CN201510770296
【发明人】杜文静, 刘锦霞, 李晶, 李娜, 丁品, 武建荣, 张建军
【申请人】甘肃省科学院生物研究所
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年11月12日