，自然冷却；
[0071] 2)待凝胶凝固后，置于电泳槽内，加入0. 5XTBE缓冲液，拔出梳子；
[0072] 3)将FTH1基因酶切产物、载体酶切产物和DNAMarker加入上样孔内；
[0073] 4)电泳：恒压 100V，时间 15 ~20min;
[0074] 5)观察电泳结果。
[0075] ?电泳鉴定后胶回收
[0076] 1)称量含pLenti-Tet-〇n-MCS-3Flag-Puro载体和FTH1基因片段的琼脂糖凝胶， 分别放入盛有溶胶液BufferDE-A的离心管内，加热至凝胶完全溶化；
[0077] 2)两管内各加入BufferDE-B，混勾后，12000rpm离心lmin;
[0078] 3)倒掉上清，加入0. 5mlBuffer W1，混勾后再次离心（2000rpm，30s)，倒掉上清加 入 0.5mlBuffer W1，混勾后再次离心（12000rpm，lmin);
[0079] 4)倒掉上清，加入Eluent25~3〇μ1，静置5min〇
[0080] 5)再次离心（12000rpm，lmin)后，所得液体为回收的目的基因FTH1 ;
[0081] ?连接反应
[0082] 将FTH1基因片段重组入线性表达载体pLenti-Tet_on-MCS-3Flag-Puro 多克隆位点内，获得pLenti-Tet-〇n-FTHl-3Flag-Puro重组慢病毒载体。 pLenti-Tet-〇n-MCS-3Flag-Puro结构图见图 1〇
[0083] 反应体系：
[0084]
[0085] 16°C，反应 12h，待转化；
[0086] ?制备感受态细胞
[0087] 1)挑取一个DH5α菌落，接种到LB液体培养基中，37°C300rpm摇床培养至其光密 度0D(600nm)为0. 3~0. 4时，移至预冷聚丙烯管内，冰上冷却至0°C;
[0088] 2)离心（4°C，4000rpm，10min)后回收细胞。
[0089] 3)倒净上清，用预冷的0.lmol/LCaClj·#液重悬细胞；离心（4 °C，4000rpm， lOmin)〇
[0090] 4)倒净上清，加入100μ1预冷的0·lmol/LCaCl2溶液，重悬细胞，分装后-70°C 保存待用；
[0091] ?重组慢病毒载体质粒转化
[0092] 1)取出备用感受态细胞，冰上缓慢融化；
[0093] 2)吸取100μ1感受态细胞悬液至无菌离心管中，每管加入10μ1连接液，旋转混 匀，冰上静置30min，再置于恒温水浴箱中90s，冰上冷却3min;
[0094] 3)每管加入800μ1LB不含氨苄青霉素（Amp)的液体培养基，混匀，37°C培养 45~60min，复苏细菌；
[0095]4)将菌液离心（5000g，5min)，倒掉一半上清液，重悬细菌，取100~200μ 1涂于 含Amp的LB琼脂培养基上；
[0096] 5)待菌液完全被培养基吸收，倒置平皿，37°C培养约16h;
[0097] 挑取长出的克隆鉴定；
[0098] ?菌落PCR鉴定
[0099]引物：TetIIP-F :5' -TGTCGAGGTAGGCGTGTA-3'
[0100]Ubi -R :5 '-ATGTCCTTCTGCTGATACTGGG-3'
[0101] PCR反应体系：
[0102]
[0103] PCR扩增条件：94°C，3min ;94°C，30s ;6(TC，30s ;72°C，30s ;72°C，5min ;30cycle ; 4°C保存；
[0104]PCR产物行1%琼脂糖胶电泳鉴定；
[0105]<^DNA测序
[0106] 任意挑选一个经电泳鉴定构建成功的阳性克隆送测序，测序结果与GeneBank中 FTH1基因（BC000857)序列比对。
[0107] ?质粒抽提
[0108]1)将阳性克隆菌液培养过夜，离心（2000rpm，lmin)，倒掉上清；
[0109] 2)加入250 μ1 Buffer S1，重悬细菌；
[0110]3)加入 250μ1 Buf f er S2，混匀，室温静置 2min;
[0111] 4)加入350 μ 1 Solution III，混勾，离心（12000rpm，lOmin);
[0112] 5)吸取上清至插有Miniprep柱的废液收集管中，再次离心（12000rpm，lmin);
[0113]6)倒掉废液，向Miniprep柱中加入700 μ 1 Buffer W2,离心（12000rpm，lmin)，重 复一次；
[0114] 7)倒掉废液，将Miniprep柱放回原收集管中，离心（12000rpm，lmin)，，彻底除去 Buffer W2；
[0115] 8)将Miniprep柱置于1. 5ml干净离心管内，加入50 μ1Eluent，室温放置lmin， 离心（12000rpm，lmin);
[0116] 9)此时所获得的液体即为抽提的重组质粒（pLenti-Tet-〇n-FTHl-3Flag-Puro)， 测定DNA浓度，-20°C保存；
[0117] ^ 293 11细胞培养
[0118] 1)复苏：取出冻存的293T细胞，37°C的恒温水浴箱中快速振荡融化；于超净台 内，将细胞液转入离心管中，加入适量完全培养基混匀后离心（lOOOrpm，5min);倒掉上清， 加入适量完全培养基，吸管吹打细胞成单细胞悬液，移至培养瓶培养，培养条件：37°C，5 % C02;
[0119] 2)换液：每24h更换培养基，继续培养；
[0120] 3)传代：细胞融合度达85%~90%即可进行传代。倒掉原培养基，PBS清洗细胞 2~3次，0. 25%胰酶进行消化，当细胞间隙增宽，细胞变圆变亮，立即倒掉胰酶，加入完全 培养基终止消化。吸管吹打瓶底使细胞脱落后，离心管中离心（l〇〇〇rpm，5min)，倒掉上清， 加入适量新鲜完全培养基重悬细胞沉淀并按适当比例传代；
[0121] 4)冻存：将对数生长期的细胞消化、离心，倒掉上清，加入配制好的冻存液，调整 细胞密度，分装至冻存管内，梯度降温冻存24h后，液氮罐内冻存备用；
[0122] ?重组质粒转染
[0123] 6)将2931'细胞接种于培养皿中，密度为6\106/1〇1111。细胞融合度约50%时可行 质粒转染；
[0124] 7)pLenti-Tet-〇n-FTHl-3Flag-Puro、pHelper1.0、pHelper2.0以 4 :3: 2 的 比例与相应体积的Opti-ΜΕΜ混合均匀，总体积2.5ml，室温温育5min ;
[0125] 8) 100μ1Lipofectamine2000 与 2.4ml Opti-MEM混匀，室温温育5min ;
[0126] 9)混合DNA稀释液和Lipofectamine 2000稀释液；
[0127] 10)将上述混合液加入293T细胞的培养液中，培养细胞6~8h弃去原培养基，加 入新鲜培养基，注意观察细胞状态；
[0128] ?慢病毒的收集、滴度测定
[0129] 3)收集转染72h的293T细胞上清液，离心（4°C，4000g，10min)，吸取上清，过滤于 离心管内，超速离心（4°C，25〇OOrpm，2min);
[0130] 4)倒掉上清，用预冷的PBS或DMEM重悬病毒，4°C冰箱过夜；
[0131] 5)次日，分装病毒悬液，-80°C保存，取一支采用ELISA法测定病毒滴度；滴度测定 滴度为lXl〇9TU/ml。
[0132] ?慢病毒感染人神经母细胞瘤细胞
[0133] 5)将SK-N-SH细胞接种在6孔板中，接种密度为1~2X105/孔；
[0134] 6)待细胞融合度达40%~50%时，可进行慢病毒感染；
[0135]7)弃掉旧培养基，加入含病毒液（2μ1)和聚凝胺（5μ g/ml)、1 μ g/ml聚乙二醇的 新鲜完全培养基，放入培养箱中继续培养；
[0136] 8) 12h后观察细胞状态，若无明显细胞毒性，继续培养10~12h后更换为无病毒的 新鲜完全培养基。
[0137] 6孔板底面积约9. 6cm2,加培养液的量为2. 5ml。
[0138] ?稳转株筛选
[0139] 1)待6孔板内感染病毒的细胞融合度达85%~90%时，胰酶消化，将细胞传代至 75ml培养瓶内培养；
[0140] 2)当细胞融合度达50%~60%时，加入含嘌呤霉素（终浓度为8μg/ml)的完全 培养基筛选7d后，降低嘌呤霉素浓度为4μg/ml，继续筛选3d可获得稳定表达抗药基因的 可诱导表达FTH1基因的细胞，命名为SK-N-SH/Tet-on/FTHl;再经传代、扩大培养后冻存， 用于后续实验。
[0141] 实验结果
[0142] 1.pLenti-Tet_on-MCS-3Flag-Puro载体和FTH1 基因PCR产物酶切鉴定： 将pLenti-Tet_on-MCS-3Flag-Puro载体和FTH1基因的PCR产物经双酶切、扩增及 琼脂糖电泳分离检测后结果（图2显示：在lOOOObp附近可见一条清晰的电泳带，与 pLenti-Tet-〇n-MCS_3Flag-Puro载体大小一致；位于500bp~750bp的电泳条带与FTH1基 因大小一致。
[0143] 2.重组质粒pLenti-Tet-〇n-FTHl-3Flag-PuroPCR鉴定：将重组慢病毒载体 pLenti-Tet-〇n-FTHl-3Flag-Puro转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取细菌克隆行PCR 鉴定。结果（图3)显示：在4号、6~11号样本中均出现一条特异性的条带，与阳性对照 (GAPDH，908bp)大小一致。2号空载自连对照组中条带与酶切后空载体片段大小（377bp) 对应。实验组与空载自连对照组电泳条带大小之差与FTH1基因片段大小一致。以上结果 表明实验组4号、6~11号成功将FTH1基因连接入Tet-on可诱导基因表达慢病毒载体。
[0144] 实施例2
[0145] 实施例1构建的SK-N-SH/Tet-on/FTHl稳定细胞株的检测
[0146] 1.Western blot测定SK-N-SH细胞诱导表达FTH1蛋白
[0147] ?强力霉素（Dox)诱导细胞FTH1表达
[0148] 1)将SK-N-SH/Tet-on/FTHl细胞按8X105密度接种到75ml培养瓶内，待细胞贴 壁后，倒掉原培养基，分为2组；
[0149] 2)第1组需8个75ml培养瓶，分别加入含不同浓度（0、0. 02、0. 2、0. 6、1、2、5、 10μg/ml)强力霉素的完全培养基，培养72h后提取细胞全蛋白；
[0150] 3)第2组需6个75ml培养瓶，加入含0·6μ g/ml强力霉素的完全培养基，分别于 0、24、48、72、96、12011提取细胞全蛋白；
[0151] ?制备细胞蛋白样品
[0152] 1)倒掉培养瓶内原培养基，用预冷的PBS彻底洗涤细