0.01mol/L, PH7.2)溶解后再加入PEG 6000至终浓度为14%，8000rpm4°C离心30min，弃上清。再用少量PBS溶解沉淀，转入透析袋(分子截留量8KD)，透析48h以上，每12h更换一次透析液，最终收集截留物质，_56°C真空冷冻干燥至粉末，-20°C保存。
[0051 ] 2)水提综合PEG法:骆驼血清与4°C冻存蒸馏水2:8混匀，调PH值至5.3，冰箱4°C静置过夜。4°C，8000rpm离心30min，过滤后取沉淀。其余步骤如PEG三步沉淀法。
[0052]实施例2
[0053]抗手足口病骆驼血清抗体效价检测
[0054]采用ELISA (酶联免疫吸附试验)法检测本发明的抗手足口病纳米抗体的效价。检测结果表明，抗手足口病纳米抗体效价达到了 1:20480。结果见图2。
[0055]效价测定步骤
[0056]1)包被:将纯化过的EV71病毒抗原用0.01M PBS 1:1000稀释至最佳包被溶度后包被于96孔酶标板上(100 μ L/孔)，37°C温育lh后，4°C过夜，次日甩干孔中液体，用PBST洗涤1次，吸水纸拍干；
[0057]2)封闭:用含3%脱脂奶粉的0.01M PBS液封闭(200 μ L/孔)，37°C温育lh后甩干，PBST洗涤3次，每次2-5min，吸水纸拍干；
[0058]3)加一抗:骆驼抗体血清用 0.01M PBS 倍比系列(1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、空白 PBS)稀释后加入 96 孔酶标板(100 μ L/ 孔)，PBS作为空白对照，37°C温育lh，甩干，PBST洗涤3次，每次2-5min，吸水纸拍干；
[0059]4)加酶标二抗:每孔加入用0.01MPBS 1:8000稀释的兔抗骆驼抗体100 μ L，置37°C温育lh。甩干，PBST洗涤3次，每次2-5min，吸水纸拍干；
[0060]5)显色和读数:用新鲜配制的TMB显色液(每孔lOOyL)，置37°C温育显色约15min后，每孔加50 μ L 2Μ H2S04S液终止反应，立即用酶标仪测定各孔在0D 450nm处吸光值。以免疫骆驼抗体与未免疫骆驼抗体阴性对照0D值之比大于2.1，且阴性骆驼抗体吸光值大于0.1做为抗体阳性的判定阈值。阳性孔0D值多2.1倍阴性孔0D值的最高稀释倍数为骆驼抗体的效价。
[0061]实施例3
[0062]免疫双向琼脂扩散检测
[0063]在凝固后的琼脂培养皿中用打孔器打梅花样孔，梅花孔中心孔加EV71病毒抗原原液，外周孔加相同量不同稀释倍数(1:4、1:8、1:16、1:32、1:64和空白孔PBS)的纳米抗体，结果见图3，当抗体以1:4、1:8、1:16稀释时，中心抗原孔与纳米抗体孔中间出现显著白色沉淀线，而空白对照孔PBS与抗原孔间没有出现沉淀线，这说明制备的纳米抗体具有与EV71抗原特异性结合的能力。
[0064]实施例4
[0065]Western blot 试验检测
[0066]将本发明所制备的抗EV71病毒纳米抗体以及EV71病毒、抗EV71病毒纳米抗体+EV71病毒进行Western blot试验。结果见图4，Western blot分析结果表明:抗EV71病毒纳米抗体特异性与其抗原EV71病毒的蛋白条带产生良好免疫结合反应，而阴性的抗EV71病毒纳米抗体与EV71病毒不具有免疫反应性。这说明本发明制备的抗肠道病毒71型纳米抗体具有良好的特异性，其中相对分子量为36KDa、24KDa左右的蛋白条带分别为EV71病毒的 VPl(a )、VP3 蛋白。
[0067]实施例5
[0068]抗手足口病骆驼血清抗体的纯度鉴定
[0069]采用SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶)电泳法，使用5%浓缩胶，12%分离胶，对本发明所制备的抗手足口病纳米抗体经过水体综合PEG法提取纯化后，骆驼血清蛋白得率达8.56mg/ml，经SDS-PAGE分析，抗体纯度达到96.46%。
[0070]实施例6体外活病毒中和实验
[0071]将抗手足口病纳米抗体冻干粉配制成lmg/mL的溶液后按1:8至1:512倍比稀释待检，体外中和活病毒实验结果见图5，其中A图为正常RD细胞，细胞状态良好，饱满，贴壁生长。B图为直接加入EV71入侵病毒后出现CPE细胞病变的RD细胞，可见细胞萎缩，脱落，凋亡。C、D、E图中RD细胞分别加入了与1:8、1:128、1:256稀释度纳米抗体作用两个小时后的EV71入侵病毒，由图可见RD细胞而未出现CPE细胞病变，细胞贴壁生长良好，说明该稀释度下的具有良好的体外抗病毒活性，能基本杀死病毒，是病毒丧失侵染寄生RD细胞的能力。F图为加入了与1:512稀释度纳米抗体作用两个小时后的EV71而出现CPE的RD细胞，该结果表明1:512稀释后的纳米抗体浓度过低，体外中和病毒能力差。综上所述可知，制备的特异性抗EV71纳米抗体在具有良好的体外中和活性，最低中和溶度为3.9 μ g/mL，中和效价为1:256。
【主权项】
1.一种抗手足口病特异性纳米抗体，其特征在于，所述的抗手足口病特异性纳米抗体依次通过下述步骤制得: 1)采用灭活纯化的EV71型病毒株制成可溶性抗原； 2)用0.01M的磷酸盐缓冲液将步骤1)制备的可溶性抗原配成0.8-1.2mg/ml抗原液，与弗氏完全佐剂按体积比1:0.8-1.2充分乳化后制得免疫抗原； 3)采用步骤2)制备的免疫抗原多点注射双峰骆驼背部皮下，平均500-700μ L/只，免疫周期为12-18天，中间加强免疫3次，采用初免相同免疫方法和剂量，免疫4个周期后，静脉取血，收集血清，3-5°C冰箱保存备用； 4)将收集到的血清，通过PEG三步沉淀法和改进水体综合PEG法进行纯化，得到纳米抗体。2.根据权利要求1所述的抗手足口病特异性纳米抗体，其特征在于，步骤1)所述的制备抗原是将EV71病毒液接种到生长至单层的横纹肌肉细胞中，每瓶加0.5mL，放入C02培养箱中培养至90 %左右细胞出现细胞病变时收获，-15-25 V冻融2-4次，3-5 V时以6000-10000rpm离心0.5-1.5h，收集病毒液3-5°C lOOOOrpm离心1.5-2.5h，弃上清，沉淀用PBS缓冲液悬浮； 2)CsCl密度梯度离心纯化病毒抗原 将CsCl装入梯度离心管中，轻轻吹打至溶解，3-5°C时以12000-18000rpm离心10-15h，3-5°C保存过夜，次日3-5°C 18000-22000rpm离心3_5h，以去除残余CsCl和上清液，加入PBS稀释纯化病毒液3-5°C，即得可溶性抗原。3.根据权利要求1所述的抗手足口病特异性纳米抗体，其特征在于，步骤2)所述的磷酸盐缓冲液pH 7.0-7.8。4.根据权利要求1所述的抗手足口病特异性纳米抗体，其特征在于，步骤3)所述的加强免疫采用初免相同免疫方法和剂量。5.根据权利要求1所述的抗手足口病特异性纳米抗体，其特征在于，步骤4)所述的PEG三步沉淀法是PEG粉末加入到骆驼血清中使其终浓度为3-6%，调PH值至7.0-7.5，充分混匀后3 - 5 °C，离心分离后过滤，弃沉淀；取上清液中加入P E G粉末使其终浓度为8.0-10.0%，调PH值至7.0-7.5，充分混匀后3_5°C，离心分离后过滤，弃上清液，沉淀用3-5°C PBS缓冲液溶解后再加入PEG至终浓度为10_18 %，离心分离后过滤后再次弃上清，再用PBS溶解沉淀，转入透析袋，透析48h以上，每12h更换一次透析液，最终收集截留物质，-50-60 °C真空冷冻干燥至粉末，_20°C保存。6.根据权利要求1所述的抗手足口病特异性纳米抗体，其特征在于，步骤4)所述的改进水体综合PEG法是骆驼血清与3-5 °C冻存蒸馏水2:6-10混匀，调PH值至5.0-5.5，冰箱3-5 V静置过夜；3-5 °C离心分离后过滤后取沉淀。7.根据权利要求1所述的抗手足口病特异性纳米抗体，其特征在于，所述的PEG粉末为PEG 6000 粉末。8.权利要求1所述的抗手足口病特异性纳米抗体的效价测定方法，其特征在于，依次包括下述步骤: 1)包被 将纯化过的EV71病毒抗原用0.01M PBS 1:1000稀释至最佳包被溶度后包被于96孔酶标板上，37°C温育lh后，4°C过夜，次日甩干孔中液体，用PBST洗涤1次，吸水纸拍干； 2)封闭 用含3%脱脂奶粉的0.01M PBS液封闭，37°C温育lh后甩干，PBST洗涤3次，每次2-5min，吸水纸拍干； 3)加一抗 骆驼抗体血清用 0.01M PBS 倍比系列 1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1: 32000、1:64000、空白PBS稀释后加入96孔酶标板，PBS作为空白对照，37°C温育lh,甩干，PBST洗涤3次，每次2-5min，吸水纸拍干； 4)加酶标二抗 每孔加入用0.01MPBS 1:8000稀释的兔抗骆驼抗体100 μ L，置37°C温育lh后甩干，PBST洗涤3次，每次2-5min，吸水纸拍干； 5)显色和读数 用新鲜配制的TMB显色液，置37°C温育显色约15min后，每孔加50 μ L 2Μ H2S04溶液终止反应，立即用酶标仪测定各孔在OD 450nm处吸光值，以免疫骆驼抗体与未免疫骆驼抗体阴性对照OD值之比大于2.1，且阴性骆驼抗体吸光值大于0.1做为抗体阳性的判定阈值，阳性孔OD值多2.1倍阴性孔OD值的最高稀释倍数为骆驼抗体的效价。
【专利摘要】本发明公开了一种抗手足口病特异性纳米抗体及其效价测定方法，旨在提供一种分子量小、水溶性好、特异性强、稳定性高的抗手足口病特异性纳米抗及其效价测定方法体；其技术要点：所述抗手足口病特异性纳米抗体依次通过下述步骤制得：1)采用灭活纯化的EV71型病毒株制成可溶性抗原；2)用0.01M的磷酸盐缓冲液将步骤1)制备的可溶性抗原配成0.8-1.2mg/ml抗原液，与弗氏完全佐剂按体积比1:0.8-1.2充分乳化后制得免疫抗原；3)采用步骤2)制备的免疫抗原多点注射双峰骆驼背部皮下，平均500-700μL/只，免疫周期为12-18天，中间加强免疫3次，采用初免相同免疫方法和剂量，免疫4个周期后，静脉取血，收集血清，3-5℃冰箱保存备用；4)将收集到的血清，通过PEG三步沉淀法和改进水体综合PEG法进行纯化，得到纳米抗体；属于免疫学技术领域。
【IPC分类】C07K16/10, C07K16/06, G01N33/543
【公开号】CN105367655
【申请号】CN201510915897
【发明人】赵肃清, 秦静, 崔锡平, 沈定, 吕瑞, 梁雨昕
【申请人】广东工业大学
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年12月11日