一种促进人角质形成细胞表达炎症因子il-8的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，具体设及一种促进人角质形成细胞表达炎症因子IL-8 的方法。
【背景技术】
[0002] 炎症因子是一类小分子多肤和糖蛋白，具有调节和介导免疫反应、炎症反应的作 用，包括白介素类、干扰素类、肿瘤坏死因子类、生长因子类W及趋化因子类。细胞受到刺激 后产生大量的炎症因子，直接或间接影响淋己细胞或周围细胞，在免疫调节、炎症反应、细 胞调亡中起重要作用。
[0003] 白细胞介素-8 (比-8)是趋化因子超家族中的一员，又称趋化因子8,它与炎症性 疾病密切相关。人的许多细胞经适当刺激后均能产生IL-8,如血管内皮细胞、上皮细胞、角 质细胞、成纤维细胞等。人的IL-8基因（基因全长519化P，由4个外显子和3个内含子组 成）是一种早期应答基因，在细胞受到刺激后，IL-8基因表达量会迅速升高。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是促进人角质形成细胞表达炎症因子IL-8。
[0005] 为解决上述问题，本发明首先提供了一种促进离体的人角质形成细胞表达炎症因 子IL-8的方法，可包括如下步骤曰2):用苯扎氯锭处理离体的人角质形成细胞。
[0006] 所述步骤曰2)中，可用浓度为0. 9-1. 0μgAiL的苯扎氯锭处理所述离体的人角质 形成细胞。
[0007] 所述步骤曰2)中，具体可用浓度为0. 973μgAiL的苯扎氯锭处理所述离体的人角 质形成细胞。
[0008] 所述步骤a2)中，用苯扎氯锭处理离体的人角质形成细胞的条件参数可为： 35-39°C、l. 5h-2.化。
[0009] 所述步骤a2)中，用苯扎氯锭处理离体的人角质形成细胞的条件参数具体可为： 37Γ、化。
[0010] 所述方法还包括如下步骤：在进行所述步骤a2)前，进行步骤al);所述步骤al) 为：将离体的人角质形成细胞的细胞悬液接种至细胞培养板，培养。
[0011] 所述步骤a2)可为：完成所述步骤al)后，取所述细胞培养板，加入苯扎氯锭并培 养。
[0012] 所述步骤al)中，所述细胞悬液中人角质形成细胞的浓度可为18000-20000个/ cm2。
[0013] 所述步骤al)中，所述细胞悬液中人角质形成细胞的浓度具体可为19000个/cm2。
[0014] 所述步骤al)中，所述培养的条件可为：35-39°C、l化-2化。
[0015] 所述步骤al)中，所述培养的条件具体可为：37°C、24h。
[0016] 所述步骤al)中，所述细胞悬液的接种量可为100μL/孔。
[0017] 上述任一所述炎症因子IL-8的基因序列可如序列表中序列1所示。
[0018] 所述苯扎氯锭的加入形式可为苯扎氯锭溶液。
[0019] 上述任一所述苯扎氯锭溶液可为用DMEM培养基溶解苯扎氯锭得到的溶液。
[0020] 上述任一所述细胞悬液的制备方法具体如下：用0. 25%膜蛋白酶消化离体的人 角质形成细胞，然后用含10%胎牛血清（体积百分比）的DMEM培养基重悬。
[0021] 上述任一所述DMEM培养基的制备方法具体如下：将高糖DMEM固体培养基（Gibco 公司产品）13. 5g和NaHC〇33. 7g依次溶于水，抑调至7. 2-7. 4,然后定容至1L。
[0022] 上述任一所述人角质形成细胞可为人表皮角质形成细胞。
[0023] 所述苯扎氯锭具体可为北京百灵威科技有限公司产品，产品目录号为#928512。
[0024] 实验证明，本发明提供的方法可W显著促进人表皮角质形成细胞中炎症因子IL-8 的表达，从而可W用于筛选治疗炎症的药物。本发明对于抗炎药物的开发具有重大价值。
【附图说明】
[0025] 图1为Μ?Τ法测定不同浓度的苯扎氯锭溶液处理人表皮角质形成细胞的存活率。
[0026] 图2为炎症因子IL-8在苯扎氯锭溶液不同处理时间下的表达量。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0028] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0029] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0030] 下述实施例中的定量实验，如无特殊说明均设置Ξ次重复，结果取平均值。
[0031] 苯扎氯锭为北京百灵威科技有限公司产品，产品目录号为#928512。
[0032] 人表皮角质形成细胞为北京富隆康泰生物技术有限公司产品；胎牛血清为 Hyclone公司产品，产品目录号为甜30084. 03 ;0. 25%膜蛋白酶为Hyclone公司产品，产品 目录号为甜30042. 01 ;DMS0为sigma公司产品，产品目录号为D2650。
[0033]DMEM培养基：将高糖DMEM固体培养基（Gibco公司产品）13. 5g和Na肥化3. 7g依 次溶于水，抑为7. 2-7. 4,定容至1L。使用0. 22μm微孔滤膜过滤除菌，于4°C保存。
[0034]MTT溶解液：将MTT(sigma公司产品）5g溶于上述DMEM培养基，定容至1L。使用 0. 22μm微孔滤胺过滤除困，于4C保存。
[0035]PBS缓冲液：购买自hyclone公司，货号甜30256. 01B。
[0036] 实施例1、确定人表皮角质形成细胞的最佳接种细胞密度和苯扎氯锭处理浓度
[0037] 设置试验组，进行Ξ次重复试验，每次重复试验的步骤均如下：
[003引1、用0.25%膜蛋白酶消化人表皮角质形成细胞，然后用含10%胎牛血清（体积百 分比）的DMEM培养基重悬并稀释，获得细胞密度为15600个/cm2的细胞悬浮液1、细胞密 度为19000个/cm2(实际应用中18000-20000个/cm2均可）的细胞悬浮液2、细胞密度为 22000个/cm2的细胞悬浮液3和细胞密度为25000个/cm2的细胞悬浮液4。
[0039] 2、用DMEM培养基溶解苯扎氯锭，获得苯扎氯锭溶液。
[0040] 3、取96孔培养板，每孔接种100μL步骤1获得的细胞悬浮液（细胞悬浮液1、细 胞悬浮液2、细胞悬浮液3或细胞悬浮液4)，在37°C(实际应用中37 + 2°C均可）、5%C〇2 环境中培养2地（实际应用中1化-2化均可）。
[0041] 4、完成步骤3后，取所述96孔板，加入步骤2制备的苯扎氯锭溶液，得到处理体 系，处理体系中的苯扎氯锭的浓度为0. 05μg/mL、0. 15μg/mL、0. 46μg/mL、1. 37μg/mL、 4. 11μg/mL、12. 35μg/mL、37. 03μg/mL、111. 1μg/mL、333. 3μg/mL或 1000μg/mL(每个 苯扎氯锭浓度设置3个复孔），5 % 0)2、37°C培养44h(实际应用中4化-4化均可），然后加 入20μLMTT溶解液，继续5%C02、37°C培养地。
[0042] 5、完成步骤4后，取所述96孔板，吸弃孔内的液体，用PBS缓冲液清洗2次，然后 每孔加入150μLDMS0,采用酶标仪检测570nm处的吸光值。
[0043] 设置空白对照组：用等体积含10%胎牛血清（体积百分比）的DMEM培养液代替 细胞悬浮液，其它操作同试验组。每个苯扎氯锭浓度设置3个复孔。
[0044] 设置细胞对照组：用等体积DMEM培养基代替苯扎氯锭溶液，其它操作同试验组。 每种细胞悬浮液设置3个复孔。
[0045]W苯扎氯锭在处理体系中的浓度为横坐标，人表皮角质形成细胞的存活率为纵坐 标，比较不同浓度的苯扎氯锭处理后人表皮角