r>[0087] 本发明的类黄酮促进HaCaT细胞的移动，但是不促进HaCaT细胞的增值。
[0088] 为了调查针对人角质形成细胞的新型类黄酮的移动诱导活性，本发明人在48小 时内在刮伤愈合试验中利用各种不同浓度的类黄酮处理HaCaT细胞。其结果是，虽然新型 类黄酮从2uM用量大幅增加 （167% )，但是在其它浓度下对HaCaT移动没有大的效果（图 1)。接着，本发明人利用相同浓度的类黄酮根据MTT试验执行增值实验，甚至在2uM用量下 角质细胞生长也没有大的变化（图2A)。与预想的相同，p53、p21、p27及两个细胞周期蛋 白激酶D、E的蛋白质水平与未处理的类黄酮相比没有大的变化（图2B)。同时，相似地，在 细胞关联基因中转录水平没有变化。这些结果表明新型类黄酮能够诱导人角质形成细胞的 移动，但是不能诱导人角质形成细胞的增值。
[0089] 新型类黄酮在HaCaT细胞中诱导MET (间质细胞-上皮细胞转变 (mesenchymal-epithelial transition))但不诱导EMT (上皮细胞-间质细胞转变 (epithelial-mesenchymal transition))〇
[0090] EMT是参与创伤愈合和组织再生的过程。已知EMT可以诱导角质细胞移动 (Journal of Dermatological Science. 58(2010)97-104)。因此，本发明人为了调查新型 类黄酮是否诱导与EMT过程关联的移动，根据蛋白质印迹和RT-PCR调查在类黄酮处理后波 形蛋白（Vimentin)、E-f丐粘蛋白（E-cadherin)及转录因子Slug等EMT标记的表达。如图 3A所示，两个间质（mesenchyma 1)标记、波形蛋白及SIug随着时间降低，而E- f丐粘蛋白、粘 着连接蛋白质大幅增加，在处理24小时后出现峰值。在mRNA水平中，在RT-PCR结果中也 观察到类似的表达（图3B)。这些数据表明新型类黄酮在HaCaT细胞中相比EMT过程诱导 MET过程。
[0091] 移动相关蛋白质根据类黄酮处理在HaCaT细胞中下调。
[0092] 如上所述，EMT过程与类黄酮的移动诱导没有关联，因此，本发明人调查诸如基质 金属蛋白酶家族（MMP，metalloproteinase family)、胶原蛋白I、胶原蛋白III的其它移动 相关蛋白质。最近，已知这些蛋白质能够调节角质细胞的移动及增值。[Growth factors and cytokines in wound healing. Stephan Barrientos I, 2 ；01ivera StojadinovicjMD.. Wound Repair and Regeneration ；Matrix Metalloproteinases and Tissue Inhibitors of Metalloproteinases: Structure, Function, and Biochemistry. Circulation Research. Robert Visse and Hideaki Nagase3,4]
[0093] 本发明人观察到在利用类黄酮处理24h后胶原蛋白I、胶原蛋白III的RNA及蛋白 质水平中的显著下调（图4A、图4B)，这可以根据MMP1、胶原酶的增加来解释（图5A)。在 利用新型类黄酮处理时由于这些蛋白酶的高的水平好像这些蛋白酶使胶原蛋白I、胶原蛋 白ΙΠ 分解。有趣的是，在利用本发明的类黄酮诱导的情况下，其它类型的细胞外基质、纤 维粘连蛋白的表达高（图4A、图4B)。这是由于通过基质切断使用纤维粘连蛋白，因此好像 与MMP7的下调相关（图5B)。
[0094] 此外，从RT-PCR结果可知，两种不同的基质金属蛋白酶MMP2和MMP9与对照组相 比较也稍微增加（图5B)。这通过针对MMP2和MMP9的明胶酶活性的酶谱法试验的数据可 知（图5C)。通常，通过由利用本发明的类黄酮诱导时表达高的胶原酶引起的胶原蛋白的分 解可以说明胶质细胞移动。
[0095] 分析利用本发明的类黄酮诱导的NADPH氧化酶表达及ROS生成。
[0096] 为了理解由本发明的类黄酮引起的角质细胞移动的机制，本发明人在下面确定与 细胞移动关联的信号传递路径以及NADPH氧化酶表达及ROS生成。如图6A所示，NADPH氧 化酶4随着时间增加，且在处理2小时后在蛋白质和mRNA水平中都达到峰值。这导致在2 小时时达到峰值的ROS生成的上调（图6B。与该初始效果一致，细胞信号传递路径在2小 时时也略微变化。与细胞移动关联的两路径AKT和ERK的磷酸化活性在pERK在30分钟时 提前增加的情况下也在至2小时期间下调。此外，JNK路径的活性化也在2小时时达到峰 值（图6C)。这些结果表明在2小时时ROS生成的初始增加及细胞内信号传递路径中存在 相伴的变化关系。
[0097] 本发明的类黄酮通过ROS生成影响信号传递路径。
[0098] 为了掌握针对信号传递路径和ROS生成的本发明的类黄酮的机制，本发明人将 DPI (NADPH抑制剂）或NAC (ROS清除剂）进行预处理，且利用本发明的类黄酮处理2小时。 与预想的相同，通过DPI及NAC的预处理抑制NADPH氧化酶4。此外，NAC减小在2小时时 通过本发明的类黄酮增加的JNK及ERK的磷酸化，而利用DPI没有该效果。有趣的是，在2 小时时通过类黄酮下调的AKT的活性化通过NAC和DPI显著缓和（图7)。这些结果表示本 发明的类黄酮通过在2小时时ROS生成诱导JNK及ERK的磷酸化，但AKT不是这样的情况。
[0099] 本发明的类黄酮改善人类的皮肤成纤维细胞的增殖。
[0100] 作为创伤愈合的第二步骤的组织生成与各种不同的细胞类型的增殖和移动相关。 通常，角质细胞开始移动后，成纤维细胞更快地生长。因此，本发明人调查针对人类的皮肤 成纤维细胞的本发明的类黄酮的全部效果。首先，本发明人调查利用各种不同用量的本发 明的类黄酮处理48小时后的皮肤成纤维细胞的增殖。MTT试验的数据表明以依据用量的形 式皮肤成纤维细胞更快地生长（图8)。2uM及5uM浓度的成纤维细胞增殖之间几乎没有差 异，为了下面的实验，本发明人使用2uM。
[0101] 为了确认利用本发明的类黄酮处理后的成纤维细胞的增殖的增加，本发明人在转 录和翻译水平中利用RT-PCR及蛋白质印迹调查细胞周期相关基因的表达。如图9所示， p21及p53、细胞周期蛋白D激酶抑制剂及肿瘤抑制蛋白的蛋白质水平分别在利用2uM本发 明的类黄酮处理24小时后显著下调。在mRNA水平中也观察到类似的结果（图9)。这些数 据表明利用2uM本发明的类黄酮处理24小时后成纤维细胞的增殖实质上增加。
[0102] 皮肤成纤维细胞根据本发明的类黄酮的诱导促进细胞外基质的积累。
[0103] 细胞外基质（ECM(Extra cellular matrix))包括作为创伤愈合物质中必须的组 成部分的胶原蛋白I、胶原蛋白III和纤维粘连蛋白。皮肤成纤维细胞是这些蛋白质的生 长细胞类型。因此，本发明人调查利用本发明的类黄酮诱导24小时后的成纤维细胞的ECM 蛋白质分泌。培养后的成纤维细胞培养液的蛋白质印迹结果表明利用本发明的类黄酮诱导 24小时后胶原蛋白I、胶原蛋白III和纤维粘连蛋白的高的生长（图10A)。RT-PCR示出类 似数据的转录水平。此外，其它间质标记、波形蛋白与对照组相比也显著增加。这表明具有 肌成纤维细胞分化及可能的移动活性。尤其，基质金属蛋白酶I(MMPl)、胶原酶蛋白质在利 用本发明的类黄酮处理的情况下显著显小（图10B)。在利用本发明的类黄酮处理的情况下 胶原蛋白I、胶原蛋白III的高的表现部分说明该结果。
[0104] 有趣的是，两种其它的基质金属蛋白酶，MMP2及MMP9，明胶酶A及明胶酶B具有相 反的表达。MMP2上升而MMP9下降。
[0105] 本发明的类黄酮在成纤维细胞中诱导作为细胞因子的TGF-β 1分泌。
[0106] 本发明人为了了解TGF-β表达与成纤维细胞中胶原蛋白的积累和增殖之间是否 有关联，调查在利用本发明的类黄酮处理时成纤维细胞中TGF-β的生长。针对培养的成纤 维细胞培养基的蛋白质印迹结果为：在蛋白质水平中TGF-β的表达稍微增加，而在转录水 平中TGF-β的表达显著增加（图11)。这表明本发明的类黄酮处理能够对TGF-β增加的 成纤维细胞产生影响。
[0107] 本发明的类黄酮通过TGF-β诱导调节细胞内信号传递路径。
[0108] 本发明人调查由本发明的类黄酮处理引起的TGF-β增加与成纤维细胞中细胞变 化之间的相关性。本发明人调查利用本发明的类黄酮处理后的成纤维细胞中信号