传递路 径、尤其TGF-β相关路径中的变化。其结果示出作为潜在的致癌基因的Akt的磷酸化以依 赖于时间的形式增加。此外，TGF-β路径具有与在1小时时pSmad2的初始活性化和6小时 时JNK的显著活性化相关联的pSmad3的高的磷酸化（图12A、图12B)。这表明本发明的类 黄酮倾向于引起支持成纤维细胞的增加的增殖的JNK/pSmad3L/c-Myc致癌基因路径的活 性化。有趣的是，ERK路径的磷酸化在一小时时初始增加后下调，甚至比正常水平更低（图 12C)。这些结果表明尤其TGF-β路径调节针对成纤维细胞的增加的增殖的支持。
[0109] 为了确认由TGF-β诱导引起的这些效果，本发明人通过TGF-β受体抑制剂 (TGFRI)预处理反复进行实验。该数据示出利用TGFRI预处理的情况下pSmad2、pSmad3、 JNK及Akt磷酸化等所有的信号传递路径的显著抑制。此外，ERK磷酸化也向由TGFRI预处 理引起的正常水平再次增加（图13)。
[0110] 以下，通过非限定性的实施例更详细地说明本发明。但是，下面的实施例意在说明 本发明，本发明的范围不应解释为由下面的实施例所限定。
[0111] 实施例1 :本发明的类黄酮合成
[0112] 如下合成本发明的类黄酮（图1)。
[0113] 化合物1的合成
[0114] 在15ml的1，4-二恶烷溶剂中溶解3g的5-甲氧基-2-羟基苯甲醛（20mmol)和 碳酸钙（3克，22_〇1)后，缓慢加入丙烯醛（2ml，28_〇1)并回流8小时。将反应混合物冷 却至常温后，加入50ml的水并稀释，并用乙醚萃取（70ml X 3)。合并所萃取的有机层，利用 MgSO4干燥、过滤、浓缩，从而得到图1所示的化合物1。
[0115] 产率：86%，熔点：48°C -50°C
[0116] 化合物2的合成
[0117] 在IOml的乙醇溶剂中溶解对硝基苯甲酸（I. 67g，IOmrnol)后，缓慢加入一水合肼 (64-65%，2ml，26mmol)。在上面的反应溶液中以催化量加入浓硫酸并回流9小时。将反应 混合物冷却至常温后，在减压小过滤形成的固体。利用乙醇使固体再结晶，从而得到图1的 纯的化合物2。
[0118] 产率：66%，熔点：144°C _146°C
[0119] 化合物3的合成
[0120] 将上述合成的化合物I (285g，I. 5mmol)和化合物2(270g，I. 5mmol)溶解在20ml 的乙醇中后，加入催化量的浓盐酸，并回流2小时。化合物1和化合物2的反应首先形成图 15的酰基腙中间体I-i，该中间体再与醛1反应，并生成图15的中间体I-ii。如果将反应 混合物冷却至常温后，则形成黄色固体，在减压下将黄色固体过滤后，用冷乙醇洗涤，从而 获得纯的化合物3。
[0121] 产率：52%，熔点：246°C _250°C
[0122] 实施例2:细胞培养
[0123] 在本发明中，本发明人使用两种细胞株：HaCaT(人永生化表皮细胞，Human spontaneously immortalized keratinocyte)细胞株、人类皮肤成纤维细胞。在补充10% 胎牛血清（FBS) (GIBCO)、1 %青霉素/链霉素（PAA)的RPMI培养基中培养HaCaT细胞株。 在补充10%胎牛血清（FBS) (GIBCO)U %青霉素/链霉素（PAA)的DMEM培养基中培养人类 皮肤成纤维细胞。在具有5%的0)2的37°C下培养细胞。
[0124] 实施例3:划伤愈合试验
[0125] 在24小时创伤愈合试验前在48孔板上对HaCaT细胞接种。接着划伤是使用将培 养皿的底部划横线的灭菌的P-200吸头而形成的。然后去除培养基。划伤后，在新的培养 基中补充本发明的类黄酮样品或作为对照组的二甲基亚砜（DMSO) (Amresco)。处理0小时、 48小时后使用配备有数码相机的OLYMPUS 1X70显微镜照4倍照片。使用ImageJ软件测量 划伤的距离。计算初始宽度和最终宽度之差。
[0126] 实施例4:MTT试验
[0127] 在96孔板上以3X IO4细胞/毫升的密度对细胞进行接种。将细胞利用本发明的 类黄酮或DMSO在HaCaT细胞株中处理24小时且在人类皮肤成纤维细胞中处理48小时。在 各个孔中添加 MTT溶液（Amresco) (5mg/ml)，且37°C下培养4小时。然后，温和地去除培养 液，利用150ul DMSO代替，搅拌30分钟，将沉淀物溶解。在吸光度570nm下测量其量。
[0128] 实施例5:蛋白质印迹
[0129] 利用本发明的类黄酮或DMSO以依赖于时间的形式或依赖于用量的形式处理细 胞。然后，利用细胞刮棒收集细胞，并利用RIPA缓冲液粉碎，利用BCA试剂盒（Thermo scientific)确定蛋白质浓度。根据使用SDS-PAGE及适当的抗体的蛋白质印迹分析其萃取 物。
【主权项】
1. 一种下列化学式1的类黄酮衍生物：2. 根据权利要求1所述的类黄酮衍生物，其特征在于：所述类黄酮衍生物诱导角质细 胞的移动，并引起角质细胞中胶原蛋白I、胶原蛋白III和纤维粘连蛋白的RNA和蛋白质水 平的下调。3. 根据权利要求1所述的类黄酮衍生物，其特征在于：所述类黄酮衍生物改善皮肤成 纤维细胞的增殖，并引起皮肤成纤维细胞中胶原蛋白I、胶原蛋白III和纤维粘连蛋白的 RNA和蛋白质水平的上调。4. 一种包括根据权利要求1至3中任一项所述的类黄酮衍生物作为有效成分的组合 物。5. -种包括根据权利要求1至3中任一项所述的类黄酮衍生物及其药学上可接受的载 体作为有效成分的用于创伤再生的药物组合物。6. -种包括根据权利要求1至3中任一项所述的类黄酮衍生物及其食品学上可接受的 载体作为有效成分的用于创伤改善的食品组合物。7. -种包括根据权利要求1所述的类黄酮衍生物作为有效成分的用于防止老化和抑 制皱纹的组合物。8. -种包括根据权利要求1至3中任一项所述的类黄酮衍生物作为有效成分的用于诱 导角质细胞移动的组合物。9. 一种利用根据权利要求1至3中任一项所述的类黄酮衍生物处理角质细胞，从而使 角质细胞的胶原蛋白I、胶原蛋白III和纤维粘连蛋白的RNA和蛋白质水平下调并诱导角质 细胞的移动的方法。10. -种利用根据权利要求1至3中任一项所述的类黄酮衍生物处理皮肤成纤维细胞， 从而改善皮肤成纤维细胞的增殖，并使皮肤成纤维细胞中胶原蛋白I、胶原蛋白III和纤维 粘连蛋白的RNA和蛋白质水平上调的方法。11. 一种用于合成根据权利要求1所述的化学式1的类黄酮衍生物的方法，包括下列步 骤： a)在1，4-二恶烷溶剂中溶解5-甲氧基-2-羟基苯甲醛和碳酸钙后，加入丙烯醛并回 流，从而获得化学式2的化合物；b) 在乙醇溶剂中溶解对硝基苯甲酸后，混合水合肼，并在其反应溶液中加入硫酸并回 流，从而获得下列化学式3的化合物；c) 将所述化学式2的化合物和化学式3的化合物溶解在乙醇中后，加入盐酸。12. -种使用包括根据权利要求1至3中任一项所述的类黄酮衍生物及其药学上可接 受的载体作为有效成分的组合物作为用于创伤再生的药物组合物的用途。13. -种使用包括根据权利要求1至3中任一项所述的类黄酮衍生物及其食品学上可 接受的载体作为有效成分的组合物作为用于创伤改善的食品组合物的用途。14. 一种使用包括根据权利要求1至3中任一项所述的类黄酮衍生物作为有效成分的 组合物作为用于防止老化和抑制皱纹的组合物的用途。15. -种使用包括根据权利要求1至3中任一项所述的类黄酮衍生物作为有效成分的 组合物作为用于诱导角质细胞移动的组合物的用途。16. -种创伤治疗方法，包括下列步骤：将根据权利要求1至3中任一项所述的类黄酮 衍生物及其药学上可接受的载体给药至个体的创伤部位。17. -种创伤部位皮肤再生及改善方法，包括下列步骤：利用包括根据权利要求1至3 中任一项所述的类黄酮衍生物作为有效成分的组合物处理创伤部位。18. -种利用包括根据权利要求1至3中任一项所述的类黄酮衍生物作为有效成分的 组合物来防止个体老化并抑制皱纹的方法。
【专利摘要】本发明涉及新型类黄酮及其用途。
【IPC分类】C07D407/12, A61P17/02, A61P17/18, A61K31/352
【公开号】CN105392786
【申请号】CN201380078394
【发明人】赵文济, 金英美, 吴曼廷, 金昭美, 高东洙, 林隆虎
【申请人】济州大学校产学协力团
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2013年11月22日
【公告号】WO2014204064A1