] 取上述菌株筛选培养基，按照1~5%的接种量接种活化后的巨大芽孢杆菌，接种 于装有2~4ml LB培养基的试管中，生长到菌体密度为0D600大约08~1. 2左右时接种 于装有50ml以葡萄糖含量在100~500g/L的上述培养基的250ml的摇瓶中，于100~140 转每分钟的摇床中，30~37°C培养。培养36~48小时测定该菌株的生长量。
[0048] 生长量的测定：取上述菌液lml，经12 000r/min离心2~5min后，利用蒸馏水重 悬，稀释适当倍数后，利用紫外-可见分光光度计于600nm处测定吸光度。经测定，该菌株能 够耐受500g/L以上的葡萄糖浓度（图1，图1巨大芽孢杆菌的高浓度葡萄糖耐受性）。从图 1可看出，菌株在400g/L的葡萄糖溶液中表现出最大生长量。其中在葡糖糖浓度为0-400g/ L范围内该菌株的生长量表现为持续增加趋势，葡萄糖浓度增加到500g/L时菌株的生长量 即出现明显的下降趋势。
[0049] 三：菌株16S rDNA鉴定
[0050] 1.培养基及材料
[0051] LB培养基含有以下成分：蛋白胨8~12g/l，酵母粉4~6g/l，氯化钠1~4g/l， pH 6. 8 ~7. 5,110°C到 115°C灭菌 25 ~35 分钟。
[0052] LA培养基：在LB培养基中添加40~100 μ g氨苄青霉素。
[0053] LB/LA固体培养基：在上述LB/LA培养基中添加1. 2%~1. 7%的琼脂。
[0054] TAE :50 倍 tris-acetate-EDTA(2M tris-acetate，0· 05M EDTA，PH 8.3)·
[0055] 琼脂糖电泳凝胶：1倍TAE电泳缓冲液添加0. 8~I. 2 %的琼脂糖凝胶。2. 16S rDNA测定
[0056] 基因组DNA的提取，在LB液体培养基中生长的5-2菌体（约12~24小时）离 心。提取基因组DNA，然后用浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳进行DNA的电泳检测。经检 测合格的DNA进行PCR基因扩增，PCR采用的引物为fDl :AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，rP2: CGGCTACCTTGTTAC GACTT ;PCR模板DNA添加0. 5 μ 1调节到合适浓度，引物浓度为0. 4 μ M， dNTP浓度为0. 2mM，DNA聚合酶大约2. 5U，反应总体积50 μ I，变性温度为94°C，退火温度 为55°C，延伸温度72°C，共30个循环。PCR产物约为I. 5kb左右，经琼脂糖凝胶电泳，溴化 乙锭染色，紫外分析仪检测，经PCR扩增得到的DNA电泳检测后连接到PMD18-T转化大肠杆 菌，转化的DH5 α菌株经过添加 LA (Luria-Bertani培养基添加50mg氨苄青霉素）培养基 筛选后，提取质粒进行电泳验证，将正确质粒进行测序，测序结果如sequence 1所示。
[0057] Sequencel ：
[0059] 将本发明的菌株的16S rDNA序列与GenBank中已登录的16S rDNA序列进行同源 比较，该16S rDNA序列与其它多株巨大芽孢杆菌的16S rDNA序列相似但不完全相同。单 个细胞0.7~0.8X2~3μπι，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢 0. 6~0. 9Χ I. 0~1. 5 μπι，椭圆到柱状，位于菌体中央稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落 表面粗糙不透明，微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。上述菌株的经通用引物 PCR获得16S rDNA序列与其它多株基巨大芽孢杆菌的16S rDNA序列有99%的相似性但是 不同。根据16S rDNA序列和形态学特征，鉴定该菌为巨大芽孢杆菌。
[0060] 四：摇瓶发酵巨大芽孢杆菌生产1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸等化 学品。
[0061] 产1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸等化学品培养基配方为：胰蛋白胨 8~2(^/1，牛肉膏2~1(^/1，似(]13~68/1，葡萄糖300~50(^凡4!1值7.0~7.4。最 佳温度为30~37°C，培养方法的转速为100~140r/min。
[0062] 取上述培养基，按照1~5%的接种量接种活化后的巨大芽孢杆菌，接种于装有 2~4ml LB培养基的试管中，生长到菌体密度为0D600大约1左右时接种于装有50ml上 述培养基的250ml的摇瓶中，培养36~48小时后测定化学品产物（产物经气相-质谱定 性图2,图2摇瓶发酵巨大芽孢杆菌生产化学品的质谱图，（a. 1-羟基-2-丁酮、b.当归内 酯、c.丙烯酸、d. 丁烯酸））。图2中横坐标代表质核比，纵坐标代表离子强度，质谱分析结 果与标准库中的色谱图作比较后显示出了与对应色谱峰相似度最高的标准图谱对应的化 学物质结构，结果表明四种主要产物对应的标准图谱化学物质分别为1-羟基-2- 丁酮、当 归内酯、丙烯酸和丁烯酸。
[0063] 每次取样时取样Iml于I. 5ml离心管，12000rpm离心2min，吸取上清液，备用。
[0064] 化学品检测：化学品的检测采用气相-质谱法，气相检测室温度270°C，气化室温 度250°C，柱室温度初始温度为50°C，2min，20°C /min升温到120°C后30°C /min升温到 240 C，保持5min后降温到50 C，元成检测。
[0065] 综上，本发明的巨大芽孢杆菌CGMCC No. 10669是一种分离的全新的菌株，该菌株 具高浓度葡萄糖耐受性，能够耐受葡萄糖浓度高达500g/L。该菌株发酵过程中合成产物包 括1-羟基-2- 丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸等，为后期利用该菌通过代谢工程改造，生产 相应的化学品奠定基础。葡萄糖的耐受度是菌株工业应用前景的一个重要指标，具有较好 的葡萄糖耐受度的菌株既能够耐受高浓度的底物，同时也能够耐受高浓度的渗透压，对于 提高产物的浓度具有重要意义。
【主权项】
1. 一种耐受高浓度葡萄糖的巨大芽孢杆菌（Bicillusmegaterium.)，其保藏编号为： CGMCCNo. 10669,保藏日期为2015年3月30日。2. -种耐受高浓度葡萄糖的巨大芽孢杆菌的应用方法，其特征在于，利用保藏编号为： CGMCCNo. 10669的巨大芽孢杆菌在耐受高浓度的糖的情况下生产1-羟基-2-丁酮、当归内 酯、丙烯酸、丁烯酸。3. 根据权利要求2所述巨大芽孢杆菌的应用方法，其特征在于，所述巨大芽孢杆菌能 够在高葡萄糖浓度的培养基里快速生长并产生1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、、丁烯 酸，具体为： 所述巨大芽孢杆菌筛选培养基配方为：胰蛋白胨8~20g/l，牛肉膏2~10g/l，NaCl3~6g/l，葡萄糖300~500g/L，pH值7· 0~7· 4,最佳温度为30~37°C， 培养时的转速为100~140r/min， 生产1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸的所述巨大芽孢杆菌菌株培养在 250ml的三角瓶中，装液量为40~80ml， 生产1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸的培养时间为36~48小时， 生产1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸的培养基的灭菌条件为110~120°C灭菌20~30分钟。4. 根据权利要求3所述的应用方法，其特征在于，利用该巨大芽孢杆菌菌株生产1-羟 基-2- 丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸时的复合氮源还可以为： 酵母浸出物+蛋白胨（1 : 1)、酵母浸出物+蛋白胨+氯化铵（2 : 2 : 1)或者酵母浸 出物+蛋白胨+尿素（2 : 2 : 1) 碳源还可以为： 甘露醇、蔗糖、果糖、麦芽糖。
【专利摘要】本发明提供了一种耐受高浓度葡萄糖的巨大芽孢杆菌(Bicillus？megaterium.)，其保藏编号为：CGMCC？No.10669，保藏日期为2015年3月30日。本发明还提供了利用保藏编号为：CGMCC？No.10669的巨大芽孢杆菌在耐受高浓度的糖的情况下生产1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸的应用方法。本发明的巨大芽孢杆菌CGMCC？No.10669是一种分离的全新的菌株，该菌株具高浓度葡萄糖耐受性，能够耐受葡萄糖浓度高达500g/L。该菌株发酵过程中合成产物包括1-羟基-2-丁酮、当归内酯、丙烯酸、丁烯酸等，为后期利用该菌通过代谢工程改造，生产相应的化学品奠定基础。CGMCC No.1066920150330
【IPC分类】C12P7/26, C12P17/04, C12R1/11, C12P7/40, C12N1/20
【公开号】CN105400712
【申请号】CN201510578504
【发明人】王倩, 刘好宝, 苏玉龙, 史素娟, 毛静静, 张鸽, 李晓旭
【申请人】中国农业科学院烟草研究所
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年9月6日