[0031](2)营养琼脂培养基的组成为:蛋白胨10.0g，牛肉浸膏3.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水 1000mL，pH 7.4±0.2 ;
[0032](3)芽孢杆菌的培养条件为:培养温度为37°C，培养时间为12h ;
[0033](4)将斜面中保存的指示菌大肠杆菌0157:H7 ATCC 43889接种至LB液体培养基中，培养温度为37°C，培养时间为12h ;
[0034](5) LB液体培养基的组成为:胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠10.0g，蒸馏水 1000mL，pH 7.0±0.2 ;
[0035](6)将活化后的指示菌大肠杆菌按照1 %加入量，加入到温度为40?65°C (还未凝固)的LB琼脂培养基中，充分混匀后，慢慢倒入到长有芽孢杆菌单菌落的琼脂培养基表面，轻轻覆盖一薄层，然后进行培养；
[0036](7)覆盖有指示菌的芽孢杆菌培养平皿，其培养温度为37°C，培养时间为12h ;
[0037](8)取出芽孢杆菌培养平皿，置于光线明亮处，观察平皿表面分离的芽孢杆菌菌落周围是否出现抑菌圈，将有抑菌圈的芽孢杆菌单菌落进行挑取；
[0038](9)将有抑菌圈的芽孢杆菌单菌落进行挑取的方法为:用接种针或无菌牙签(或无菌枪头)穿破目标单菌落上层的指示菌琼脂，小心挑取下层的芽孢杆菌单菌落，然后进行划线纯化、保存。
[0039]实施例2抗单增李斯特菌的芽孢杆菌的筛选
[0040](1)称取25.0g 土壤样品，加入到含有225mL无菌生理盐水的三角瓶中，37°C充分振荡摇匀20min ;然后将装有样品的三角瓶置于80?90°C的水浴锅中，水浴处理30min，水浴期间振荡三角瓶5次，再将高温处理后的样品用无菌生理盐水进行梯度稀释，将稀释104?106倍的菌悬液涂布于营养琼脂培养基表面。
[0041](2)营养琼脂培养基的组成为:蛋白胨10.0g，牛肉浸膏3.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水 lOOOmL，pH 7.4±0.2 ;
[0042](3)芽孢杆菌的培养条件为:培养温度为37°C，培养时间为12h ;
[0043](4)将斜面中保存的指示菌单增李斯特菌CMCC 54002接种至BHI液体培养基中，培养温度为37°C，培养时间为12h ;
[0044](5) BHI液体培养基的组成为:胰蛋白胨10.0g，牛心浸粉17.5g，氯化钠5.0g，葡萄糖 2.0g，磷酸氢二钠 2.5g，蒸馏水 1000mL，pH 7.4±0.2 ;
[0045](6)将活化后的指示菌单增李斯特菌按照1%加入量，加入到温度为40?65°C (还未凝固)的BHI琼脂培养基中，充分混匀后，慢慢倒入到长有芽孢杆菌单菌落的琼脂培养基表面，轻轻覆盖一薄层，然后进行培养；
[0046](7)覆盖有指示菌的芽孢杆菌培养平皿，其培养温度为37°C，培养时间为12h ;
[0047](8)取出芽孢杆菌培养平皿，置于光线明亮处，观察平皿表面分离的芽孢杆菌菌落周围是否出现抑菌圈，将有抑菌圈的芽孢杆菌单菌落进行挑取，如图1所示；
[0048](9)将有抑菌圈的芽孢杆菌单菌落进行挑取的方法为:用接种针或无菌牙签(或无菌枪头)穿破目标单菌落上层的指示菌琼脂，小心挑取下层的芽孢杆菌单菌落，然后进行划线纯化、保存。
[0049]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1.一种快速筛选具有抗菌活性芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述筛选方法包括如下步骤: .1)样品的稀释:稀释样品，得到样品稀释液； .2)样品稀释液的高温处理:将装有样品稀释液的三角瓶置于80?90°C的水浴锅中，水浴处理30min，期间振荡三角瓶3?5次； .3)芽孢杆菌的分离培养； .4)指示菌的琼脂覆盖； .5)抑菌圈的观察、目标菌的挑取分离和目标菌的纯化。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)具体为:将活化后的指示菌按照1 %?5%的加入量，加入到温度为40?65°C未凝固的LB琼脂培养基或BHI琼脂培养基中，充分混匀后，慢慢倒入到长有芽孢杆菌单菌落的琼脂培养基表面，使其刚好覆盖芽孢杆菌的菌落，然后进行培养，培养温度为35?42°C，培养时间为6?12h ; 所述指示菌为细菌，优选单增李斯特菌CMCC 54002、金黄色葡萄球菌ATCC 6538、猪霍乱沙门氏菌 CGMCC 1.1859、大肠杆菌 0157:H7ATCC 43889。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，指示菌的活化步骤为:将斜面中保存的指示菌接种于LB液体培养基或BHI液体培养基，培养温度为35?42°C，培养时间为12h。4.根据权利要求1?3任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤1)具体为:称取样品加入到含8?10倍(优选9倍)体积无菌生理盐水的三角瓶中，35?38°C (优选37°C )充分振荡摇勾。5.根据权利要求1?3任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤3)具体为:将高温处理后的样品稀释液用无菌生理盐水进行梯度稀释，将稀释102?106倍的菌悬液涂布于营养琼脂培养基的表面进行分离培养；所述营养琼脂培养基的组成为:蛋白胨10.0g，牛肉浸膏 3.0g，氯化钠 5.0g，琼脂 15.0g，蒸馏水 1000mL，pH 7.4±0.2。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述分离培养的培养条件为:培养温度为.35?42°C，培养时间为12?24h。7.根据权利要求1?3任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤5)中:将培养后的指示菌琼脂覆盖的平板置于光线明亮处，观察芽孢杆菌菌落周围是否存在抑菌圈，将有抑菌圈的芽孢杆菌单菌落进行挑取。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述挑取方法为将有抑菌圈的芽孢杆菌单菌落进行挑取的步骤包括:用接种针或无菌牙签或无菌枪头穿破目标单菌落上层的指示菌琼脂，小心挑取下层琼脂中的芽孢杆菌菌落，然后在营养琼脂培养基上进行划线纯化、保存。9.根据权利要求1?3任一项所述的方法，其特征在于，所述样品为土壤、发酵食品、动物肠道内容物或粪便。10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述LB琼脂培养基的配方为:胰蛋白胨.10.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠10.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.0±0.2 ;所述冊1琼脂培养基的配方为:胰蛋白胨10.0g，牛心浸粉17.0g，氯化钠5.0g，葡萄糖2.0g，磷酸氢二钠2.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.4±0.2 ;所述LB液体培养基的配方为:胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠10.0g，蒸馏水lOOOmL，pH 7.0±0.2 ;所述BHI液体培养基的配方为:胰蛋白胨10.0g，牛心浸粉17.0g，氯化钠5.0g，葡萄糖2.0g，磷酸氢二钠.2.0g，蒸馏水 lOOOmL，pH 7.4±0.2。
【专利摘要】本发明涉及微生物筛选领域，具体公开了一种快速筛选具有抗菌活性芽孢杆菌的方法。利用高温处理快速除去杂菌，并利用指示菌进行琼脂覆盖，通过观察抑菌圈筛选具有抗菌活性芽孢杆菌。可在35～42℃的培养条件下，在琼脂覆盖后培养6～12h内观察到抑菌圈，实现具有抗菌活性芽孢杆菌的高效筛选，整个筛选过程在48h内即可完成，大大简化了筛选的程序，降低了劳动强度。且本方法所述方法只利用了几种较为简单的培养基，无需滤纸片、牛津杯等试验材料，筛选成本低。
【IPC分类】C12Q1/04, C12N1/20
【公开号】CN105400721
【申请号】CN201510920030
【发明人】周辉, 刘成国, 方俊, 田云, 葛龙
【申请人】湖南农业大学
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年12月11日