一种复合微生物菌剂及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及复合微生物菌剂，具体地说，涉及一种用于处理中草药废液的复合微 生物菌剂。
【背景技术】
[0002] 中草药是中华民族传统的瑰宝，因其独特的功效，其在世界医学中有着重要的地 位。随着时代的发展，我国的中草药制药发展迅速，据统计，目前市场上的中草药厂家大约 有2000多家。中草药在制药在生产过程中会产生大量的废液，废液大部分是直接排出，或 进入污水处理系统。中草药废液中含有大量的有机物，以及糖类、木质素、生物碱等污染物， 直接排出会污染地下水，而且产生的臭气会严重影响人们的生活和健康。研究发现，中草药 废液中丰富的有机物、氮源以及微量元素进行合理处理可以在利用，对可持续发展具有重 要影响。
[0003] 当前，处理中草药废水的方法依然沿用的是制药废水的处理方法，包括物化法和 生物法。其中物化法主要是混凝法、吸附法、电解法及气浮法等。主要是他通过物理吸附、 化学沉底及化学氧化法，将废液中的有害物进行吸附、氧化，从而达到去除污染的目的。有 研究表明，中药废水经过气浮法处理后，COD的去除率可以达到50%，固体悬浮物的去除率 达到80%以上，但同时处理后的废液中仍然有大量的有机物，需要进一步的处理。目前，我 国利用物化法处理中草药废液的具体案例较少，主要是成本太高，劳动强度大，产生二次污 染，具有一定的局限性。生物法主要是采用厌氧及好氧的方法，能够有效的去除废液中的大 部分污染物，其中好氧生物法包括活性污泥、曝气氧化池处理等方法，厌氧处理法包括厌氧 固定生物反应器、厌氧稳定塘等方法。这些方法的处理特点是将中草药废液单纯的作为污 水处理，而其中的有机物、氮源及微量元素等物质没有得到进一步的应用，从能源循环利用 的方面来说，这种方法是不可取的。如何在处理中草药废液的同时充分利用中草药废液中 有机物、氮源等物质是一项重要的研究内容。近些年有些企业尝试利用微生物将中草药进 行发酵，通过微生物的分解作用，将废液中的有机物、氮源等物质进行分解、转化，得到的产 品在添加一些营养成分，将其制作成生物肥料，是一个有益的尝试。然而，由于中草药废液 中有机物、COD及有害物质含量较高，对微生物的耐受性有很高的要求，到目前为止还未有 专门的微生物菌剂针对处理中草药废液。
【发明内容】
[0004] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种用于处理中草药废液 的复合微生物菌剂及其制备方法与应用。
[0005] 为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
[0006] 第一方面，本发明提供一种复合微生物菌剂，所述复合微生物菌剂包括：枯草芽孢 杆菌、巨大芽孢杆菌、毕赤酵母和毛霉。
[0007] 本发明在进行了大量客观实验的研究基础上，综合利用了枯草芽孢杆菌的快速分 解木质素，纤维素等有机物的特性，巨大芽孢杆菌的抗病原菌特性、毕赤酵母的分解有机物 的特性和毛霉的产生蛋白酶和脂肪酶分解小分子肽和氨基酸的特性，针对中草药废液中的 有机物等物质更好的进行处理或分解，以实现本发明的发明目的。
[0008] 进一步地，所述复合微生物菌剂的总活菌数不低于3X 10scfU/mL。满足该条件的 复合微生物菌剂能够更好的对中草药废液中的有机物等物质进行分解。
[0009] 更进一步，所述复合微生物菌剂中：枯草芽孢杆菌的活菌数为lX10s-6X10 scfU/ mL，巨大芽孢杆菌的活菌数为I. 5X 107-5X 107cfu/mL，毕赤酵母的活菌数为 2X 10S-4X 10scfu/mL，毛霉的活菌数为I X 106-4X 106cfu/mL。当所述复合微生物菌剂满足 上述条件时，各微生物能够充分发挥各自的功效，迅速分解废液中的相关成分，如：枯草芽 孢杆菌能够产生大量纤维素酶和半纤维素酶，分解废液中木质素、纤维素等物质，巨大芽孢 杆菌能够产生大量的脂肽、多肽等抗菌物质，有效抑制废液中的大肠杆菌等病原菌、毛霉能 够产生蛋白酶和脂肪酶，可以分解废液中的小分子肽和氨基酸等。所述枯草芽孢杆菌、巨大 芽孢杆菌、毕赤酵母和毛霉市售可得。
[0010] 作为优选，本发明提供了在分解中草药废液中污染物效果上更优的菌种，如： 所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌VTS - 2 (Bacillus subtilis)，所述巨大芽孢杆菌为 VTS - I (Bacillus megatherium)，所述毕赤酵母为毕赤酵母 VTJ - 6 (Pichia pastoris)，所 述毛霉为犁头霉VTJ - 3 (Absidia)。
[0011] 第二方面，本发明提供了前述复合微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
[0012] 1)固体斜面培养：将枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌分别接种于牛肉膏蛋白胨固体 培养基中，毕赤酵母、毛霉分别接种于PDA固体培养基中培养，使菌株充分活化；
[0013] 其中，牛肉膏蛋白胨固体培养基配方为牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，水 lOOOmL，琼脂20g。PDA固体培养基配方为土豆200g，葡萄糖20g，水lOOOmL，琼脂20g。
[0014] 2) -级种子培养：将步骤1)中活化的枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌分别接种于牛 肉膏蛋白胨培养基中，活化的毕赤酵母、毛霉分别接种于PDA培养基中培养，当液体培养菌 密度OD 6。。值达到0. 6-0. 8时停止培养，分别获得一级种子液；
[0015] 其中，牛肉膏蛋白胨培养基配方为牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，H2O 1000 mL; PDA培养基配方为土豆200g，葡萄糖20g，H201000mL。
[0016] 3)二级种子培养：将所得枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌的一级种子液分别接种于 牛肉膏蛋白胨培养基中培养，所得毕赤酵母、毛霉的一级种子液分别接种于PDA培养基中 培养，分别获得二级种子液；
[0017] 其中，所述牛肉膏蛋白胨培养基和PDA培养基同步骤2)。
[0018] 4)将步骤3)中获得的4种微生物的二级种子液分别接种于发酵培养基中，进行高 密度发酵培养，得到菌剂A、B、C、D ;
[0019] 其中，菌剂A为由枯草芽孢杆菌制备的菌剂，菌剂B为由巨大芽孢杆菌制备的菌 剂、菌剂C为由毕赤酵母制备的菌剂，菌剂D为由毛霉制备的菌剂。
[0020] 5)将菌剂A、B、C、D混合，即得复合微生物菌剂。
[0021] 作为优选，所述菌剂A、B、C、D以1-3:1-3:1-3:2-3的体积比混合。所述菌剂A、B、 C、D在该体积比例下混合，能够使复合微生物菌剂具有更好的菌种数量组成从而达到最佳 的处理中草药废液的效果。
[0022] 作为优选，步骤4)中所述的发酵培养基的配方按质量百分比为：糖蜜4-6%、玉米 粉 0· 35-0. 45%、硫酸铵 0· 5-0. 7%，磷酸二氢钾 0· 05-0. 15%，硫酸镁 0· 05-0. 15%，余量为 水，pH为7. 0-7. 2。该培养基特别适宜前述微生物种子液的发酵。
[0023] 进一步地，所述步骤1)的培养条件为在28_30°C下培养1-3天；所述步骤2)和3) 的培养条件为在28-30°C，160-180rpm下培养1-3天；所述步骤4)具体为：
[0024] 枯草芽孢杆菌二级种子液以5-15 %的接种量接种于发酵培养基中，于28_30°C， 110_150rpm，通气量1.0 -L 5vvm下进行高密度发酵培养l_2d ;
[0025] 巨大芽孢杆菌二级种子液以5-15 %的接种量接种于发酵培养基中，于28-30°C， 160_200rpm，通气量1.0 -L 5vvm下进行高密度发酵培养l_2d ;
[0026] 毕赤酵母二级种子液以10-20%的接种量接种于发酵培养基中，于28-30 °C， 110_150rpm，通气量0· 8-1. Ovvm下进行高密度发酵培养l_2d ;
[0027] 毛霉二级种子液以10-20 %的接种量接种于发酵培养基中，于28-30 °C， 110_150rpm，通气量0· 8-1. Ovvm下进行高密度发酵培养l-2d。
[0028] 按照上述接种量接种以上种子液进行发酵，能够保证各菌种发酵后的数量以及菌 株产生的次级代谢产物的量。
[0029] 第三方面，本发明提供了前述复合微生物菌剂在处理中草药废液中的应用。
[0030] 作为优选，将所述复合微生物菌剂以0. 05% v/v的比例加入到中草药废液中，于 28°C，160rpm，通气量L O-L 5vvm下进行好氧发酵5d。当所述复合微生物菌剂按照上述条 件对中草药废液进行处理，能够使菌剂更好的发挥分解效果，提高菌剂分解中草药废液中 有机物的速率。
[0031] 第四方面，本发明提供了一种复合微生物水溶性肥，其原料来自经前述复合微生 物菌剂处理后的中草药废液。当中草药废液经前述复合微生物菌剂后，含有丰富的微生物 种群及各