专利名称：对复合肥料耐受的地衣芽孢杆菌的筛选方法
技术领域：
本发明属于微生物领域，涉及一种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的筛选驯化方法以及得到的地衣芽孢杆菌，是应用于肥料中提高地衣芽孢杆菌对复合肥的耐受性。
背景技术：
地衣芽孢杆菌，拉丁学名Bacillus licheniformis，是芽孢杆菌属的一种。单地衣芽孢杆菌细胞形态和排列呈杆状、单生，能产生抗活性物质，并具有独特的生物夺氧作用机制，能抑制致病菌的生长繁殖。地衣芽孢杆菌能够抑制土壤中病原菌的繁殖和对植物根部的侵袭，减少植物土传病害，预防多种害虫爆发，因此被应用于肥料中。例如CN101955903A公开的“一种地衣芽孢杆菌及其应用”，CN101891M8A公开的“一种三株地衣芽孢杆菌制作的多效微生物菌肥”，上述文献均涉及了地衣芽孢杆菌在肥料中的应用。然而，由于地衣芽孢杆菌对盐的耐受性较差，高浓度的盐能够抑制菌株。因此，目前地衣芽孢杆菌均是用于生物有机肥，或低含盐里的复合肥。这限制了地衣芽孢杆菌在肥料中的应用。而复合肥主要成分为无机盐，使得将地衣芽孢杆菌与复合肥混用时大部分地衣芽孢杆菌不能存活。
发明内容
本发明的目的就在于提供一种对复合肥料耐受的地衣芽孢杆菌的筛选方法。本发明采用如下技术方案一种对复合肥料耐受的地衣芽孢杆菌的筛选方法，包括如下过程(1)筛选将地衣芽孢杆菌CGMCC 1. 0518，以营养琼脂为培养基，先进行试管斜面培养，然后再进行培养皿斜面划线培养后筛选出典型的地衣芽孢杆菌的单菌落；将典型的地衣芽孢杆菌转入营养琼脂试管斜面，进行培养；(2)驯化在营养琼脂培养基里增加复合肥，制成复合肥浓度不同的培养皿，把步骤(1)中最后培养得到的地衣芽孢杆菌先在磷酸氨二铵浓度较低的培养皿中划线培养；将培养的单菌落转移到试管斜面培养后作为菌种，再在下一个复合肥浓度较高的培养皿中划线培养，以此类推，逐步提高复合肥浓度，筛选出能够耐受较高浓度复合肥的地衣芽孢杆菌。所述步骤O)中复合肥质量浓度可以分别为10%、15%、20%和25%。所述营养琼脂组成为每IOOOml水用蛋白胨10克、牛肉粉3. 0克和氯化钠5. 0克， PH 值为 7. 3 士 0. 1。各步骤中所述培养条件为恒温培养箱中34°C 士0. 5°C培养3-5天。本发明的方法得到的地衣芽孢杆菌，通过筛选、驯化，在质量浓度为20%的复合肥营养琼脂中生长良好，表明能够耐受质量浓度为20%的复合肥。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明作进一步详细描述，以助于理解本发明的内容。地衣芽孢杆菌Bacillus Iicheniformis来源，中科院微生物所的中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)购买，编号为1.0518。所用分离基础培养基营养琼脂培养基蛋白胨10克牛肉粉3. 0克氯化钠5.0克水1000mlpH 值7·3士0.1筛选驯化方法(1)准备按照营养琼脂培养基标准配制好培养基，连同包好的培养皿、试管培养基、无菌水、玻璃刮刀、移液管等辅助器具，经过高温灭菌后待用。灭好菌的营养琼脂培养基倒平板，试管培养基摆斜面，冷却，备用。(2)复壮超净工作台开紫外灯灭菌30分钟，实验室甲醛熏蒸，准备工作做好后，吸0. 2毫升的无菌水加入冻干管中，将地衣芽孢杆菌菌种干粉做成菌悬液，在火焰封口的状态下倒入制备好的试管斜面上，将菌悬液平铺在斜面培养基上，放入恒温培养箱中 340C 士 0.5 °C，培养3-5天。镜检观察形态，芽孢率。(3)筛选在菌种操作间，将超净工作台开紫外灯灭菌30分钟，进行无菌操作，用接种针在培养好的试管斜面菌种挑起菌落，在准备好的培养皿中划线，将划好线的培养皿放入恒温培养箱中34°C 士0. 5°C，培养3-5天，观察是否有典型的地衣芽孢杆菌的单菌落形成。将典型的地衣芽孢杆菌的单菌落，转入准备好的营养琼脂试管斜面上，放入恒温培养箱中34°C 士0. 5°C，培养3-5天，待用。(4)驯化在营养琼脂培养基里相应增加复合肥的浓度，按照质量分数10%、 15%、20%、25%各个浓度，制备成培养皿；在培养好的营养琼脂试管斜面上，挑菌种先在 10%复合肥营养琼脂培养皿内划线培养，然后以前一批次的单菌落存试管斜面，培养结束后，作为菌种在下一个浓度的培养皿中划线培养，依次类推。根据实验结果表明复合肥的浓度(质量分数)在20%时，本菌株能生长良好，作为驯化后的菌种。复合肥中Ν、Ρ205 *Κ20 的百分含量分别为20%、10%和10%。(5)、检测选取营养琼脂培养基加入质量分数为20%浓度的复合肥，高压灭菌后，用灭菌后的培养皿倒平板。划线或者稀释平板涂布，34°C 士0.5°C培养，3-5天生长出单菌落，表面经过筛选驯化后的地衣芽孢杆菌能够耐受20%浓度的复合肥。(6)生物学鉴定驯化后得到的能够耐受20%浓度复合肥的地衣芽孢杆菌，进行生物学鉴定，鉴定结果为革兰氏阳性细菌，杆长2. 5-3. 5 μ m,杆宽0. 8-1. 5 μ m,产生近中生的椭圆状芽孢， 孢囊稍膨大。细胞形态和排列呈杆状、单生。无荚膜，无鞭毛，能运动。细胞内无聚_羟基丁酸盐在普通琼脂平板上极易生长，菌落形态为扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙皱褶。地衣芽孢杆菌可产生乙酰甲基甲醇，兼营性厌氧生活；可分解葡萄糖、甘露醇及木糖产酸，但不能分解阿拉伯糖产酸；石蕊牛奶呈还原胨化反应，能分解淀粉和酪素，能利用柠檬酸盐。
驯化前后对比将驯化前的菌株和驯化后的菌株分别接入液体培养基培养，待95%以上芽孢形成下摇床准备平板计数。结果如表1 表1驯化前后地衣芽孢杆菌存活情况
菌株(地衣)处理梯度平行(107)平均数驯化前营养琼脂170169173168170驯化前20%复合肥营养琼脂8386848384驯化后营养琼脂165164163167165驯化后20%复合肥营养琼脂120121123120121 驯化前菌株的存活率在49. 4%，驯化后的菌株存活率能达到73.3%，表明经过驯化后地衣芽孢杆菌对复合肥的耐受能力得到显著增强。
权利要求
1.一种对复合肥料耐受的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的筛选方法，其特征在于包括如下过程(1)筛选将地衣芽孢杆菌CGMCC1.0518，以营养琼脂为培养基，先进行试管斜面培养，然后再进行培养皿斜面划线培养后筛选出典型的地衣芽孢杆菌的单菌落；将典型的地衣芽孢杆菌转入营养琼脂试管斜面，进行培养；(2)驯化在营养琼脂培养基里增加复合肥，制成复合肥浓度不同的培养皿，把步骤 (1)中最后培养得到的地衣芽孢杆菌先在磷酸氨二铵浓度较低的培养皿中划线培养；将培养的单菌落转移到试管斜面培养后作为菌种，再在下一个复合肥浓度较高的培养皿中划线培养，以此类推，逐步提高复合肥浓度，筛选出能够耐受较高浓度复合肥的地衣芽孢杆菌。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中复合肥质量浓度分别为 10%、15%、20%禾口 25%。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述营养琼脂组成为每IOOOml水用蛋白胨10克、牛肉粉3. 0克和氯化钠5. 0克，PH值为7. 3士0. 1。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于各步骤中所述培养条件为在恒温培养箱中34°C 士0. 5°C培养3-5天。
全文摘要
本发明属于微生物领域，涉及一种对复合肥料耐受的地衣芽孢杆菌的筛选方法，包括如下过程(1)筛选将CGMCC保藏的编号为1.0518的地衣芽孢杆菌，以营养琼脂为培养基，先进行试管斜面培养，然后再进行培养皿斜面划线培养后筛选出典型的地衣芽孢杆菌的单菌落；将典型的地衣芽孢杆菌转入营养琼脂试管斜面，进行培养；(2)驯化在营养琼脂培养基里增加复合肥，制成复合肥浓度不同的培养皿，逐步提高复合肥浓度进行筛选驯化培养，筛选出能够耐受较高浓度复合肥的地衣芽孢杆菌。得到能够耐受质量浓度为20％复合肥的地衣芽孢杆菌，这种地衣芽孢杆菌可用于肥料。
文档编号C12N1/20GK102344896SQ20111022206
公开日2012年2月8日 申请日期2011年8月4日 优先权日2011年8月4日
发明者冯作山, 周正峰, 尹川, 李宝成, 解丽娟 申请人:双赢集团有限公司