一种利用溶剂分级结晶分离虾青素单双酯的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于天然产物分离技术领域，具体涉及一种利用溶剂分级冷却结晶制备虾 青素单酯和虾青素双酯的方法。 技术背景
[0002] 虾青素以8七31311让丨11，3,3'-二羟基-4,4-二酮基-0，0'-胡萝卜素），是一种红色酮 式类胡萝卜素，发现于某些水生动物体内。据报道，虾青素的抗氧化性比β-胡萝卜素高10倍以 上，比维生素Ε高500倍以上，被称为"超级维生素Ε"。虾青素可作为着色剂应用于贵重水产 品及禽类养殖以增加其附加商品值，此外，人体也可选择性积累虾青素，有抗氧化、抗衰老、 抗肿瘤、预防心脑血管疾病等功效。因此近年来受到广泛关注。
[0003]因虾青素具有抗氧化、抗炎、着色、光保护、促进繁殖等多种生物学功能，近年来甚 受国内外的食品、医药、化妆品、水产养殖等行业的关注。研究发现，在自然界中虾青素90% 以上以酯化形式存在，酯化虾青素较游离虾青素稳定。并且大多产品的制备、储存和应用均 以虾青素酯的形式进行。虾青素、酯化虾青素的结构如图1所示。
[0004] SHOWALTERLA，CARD0UNEL1AJ，WADEAΝ等研究表明，随着虾青素酯化程度的加 深，虾青素体现为疏水性增强，且更容易被动物组织所吸收利用。在对龙虾等动物的研究 中，就证实酯化虾青素比游离虾青素容易被吸收并与外骨骼结合，从而使动物有效着色。特 别值得关注的是，酯化虾青素的形态对其稳定性和吸收利用率具有重要影响，Harukazu FUKAMI等研究表明，单酯形式的类胡萝卜素和双酯形式的类胡萝卜素在消化吸收特性方面存 在差异。因此，探索一条高效纯化制备虾青素单酯和虾青素双酯的工艺路线，对于研究不同 结合形态的虾青素在理化性质和消化吸收特性差异性具有重要意义，并且为虾青素单酯和 双酯的开发应用奠定基础。
[0005]本发明提供一种利用溶剂分级结晶纯化虾青素单酯和双酯的方法，对虾青素研究 与应用推广，以及带动药保健品、水产养殖业以及家禽业等各方面的发展，具有重要意义。
【发明内容】
[0006]本发明提供一种利用溶剂分级冷却结晶分离虾青素单酯和虾青素双酯的方法，能 够有效的将虾青素单酯和虾青素双酯从提取的虾青素酯中分离出，从而弥补现有技术的不 足。
[0007]本发明的方法，包括有如下的步骤：
[0008] 1)将虾青素酯粗提物加入到无水乙醇中，在50~70°C条件下搅拌，至充分溶解，然 后将上述溶液体系置于35~38°C条件下静止放置1~6h，然后经离心或过滤，收集清液；
[0009] 2)将步骤1)收集得到的清液或滤液置于18~28°C条件下静止放置1~6h，然后经 离心或过滤，收集析出物；
[0010] 3)将步骤2)得到的析出物利用乙醇溶液洗涤1~3次，然后对析出物进行干燥，得 到虾青素双酯，洗涤液经回收循环利用；
[0011] 4)将步骤2)得到的离心清液或滤液置于4~15°C条件下，静止1~6h后进行离心或 过滤，收集析出物，所得清液或滤液返回步骤1或经减压回收重复利用；
[0012] 5)将步骤4)收集得到的析出物利用乙醇溶液洗涤1~3次，然后经干燥得到虾青素 单酯。
[0013]所述的虾青素酯粗提物的制备方法如下：
[0014] 以雨生红球藻、南极磷虾、对虾、蟹为原料，以乙醇、乙酸乙酯和正己烷中的一种或 几种作为提取溶剂，按照料液比为1:3~20浸提1~24h，浸提结束后，经过滤或离心收集浸 提液，然后浸提液经减压浓缩至无溶剂流出，回收浸提溶剂，得到的浓缩物即为虾青素酯粗 提物。
[0015] 步骤3)所述洗涤用乙醇溶液为无水乙醇或体积分数70~95%的乙醇水溶液，并且 洗涤用溶液的温度在15~20°C。
[0016] 步骤5)所述洗涤用乙醇溶液为无水乙醇或体积分数70~95%的乙醇水溶液，并且 洗涤用溶液的温度控制在4~10°C。
[0017]本发明选用的溶剂饱和低级脂肪醇，是相对极性较强的溶剂，在适当加热的条件 下对虾青素酯粗提物中各组分具有较好的溶解性，而随着温度的降低，对不同极性的组分 的溶解度变化差异较大，若在醇中加入适量的水，则可使溶剂的极性发生变化，更有利于虾 青素酯的分离，而且，由于甘油和水的无限混溶性，使得虾青素酯粗提物中的甘油更容易被 除去，同时，水的存在更利于除去体系中的高极性杂质，如：叶绿素及其盐，脂肪酸盐等。而 醇对脂肪酸具有良好的溶解性，使得脂肪酸也可被除去。由此可见，利用饱和低级脂肪醇的 复合溶剂对虾青素酯粗提物进行分级结晶分离，可获得良好的分离效果。本工艺流程简单， 无污染，易于工业化。
【附图说明】
[0018] 图1:虾青素、虾青素单酯及虾青素双酯的结构图，其中R为饱和或不饱和的烃链；
[0019] 图2:本发明的工艺流程图；
[0020] 图3:实施例2产物的TLC分析图，其中1:雨生红球藻粗提物，2:奸青素双酯组分;3: 虾青素单酯组分；
[0021] 图4:实施例2产物的HPLC-DAD分析图。
【具体实施方式】
[0022] 申请人在长期的研究中发现，通过控制冷析温度能够使虾青素酯粗提物中大部分 的甘油酯析出，而只有少量的虾青素酯析出，从而达到从虾青素酯粗提物中除去甘油酯的 目的;进一步通过控制冷析温度，可使虾青素二酯和虾青素单酯分级析出。
[0023] 以下采用实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段 来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。虾青素单酯和双酯 的定性定量分析：
[0024]本发明采用薄板层析法和高效液相色谱法对虾青素酯粗提物在分级结晶分离过 程中的各组分析出物进行定性、定量分析检测。
[0025]TLC分析
[0026] 实验步骤：准确称取10 .Omg样品，加入10ml二氯甲烷溶解，震荡提取lOmin;在 6000r/min条件下离心30min，取上清液点样；以正己烧:丙酮=4:1(V/V)配制展开剂60ml， 置于展开槽中平衡；以Φ3_的点样毛细管点样，展开，其间观察并记录现象。
[0027] HPLC分析
[0028] 准确称取2.Omg样品，加入10ml色谱纯二氯甲烷溶解，经0.22μπι有机膜过滤，然后 进行HP