酵罐温度为28°C，流加甲醇，采用蠕动栗，蠕动速率为1/7,即每 七秒周期内运转一秒，流加速率为3.55ml/h/L，以控制溶氧在18 %-22 %，设置转速为 650rpm，通气流量为1L/(L·min)，罐压为0.05MPa并保持不变，此时，菌体生物量会不断增 加，待生物量达到250g/L时，作为此阶段的结束，本阶段总诱导时长为20-25h，随后可进入 混合加大诱导阶段。
[0043]混合加大诱导阶段：
[0044]此阶段调节发酵罐温度由28°C降为25°C，创造低温环境，调整通气量由1L/(L·min)提高至1.3L/(L·π?η)，罐压升高至0.07MPa，为发酵提供高动力，此时溶氧升高，加大 甲醇的流加速率至9.0ml/h/L以维持18 % -22 %的溶氧，一直维持到发酵结束，菌体湿重维 持恒定或下降幅度超过20g/L作为发酵结束的标准，此阶段维持时间在40-50h，菌体湿重最 终可达280g/L，蛋白产量可达3 · 3g/L。
[0045] (4)将步骤(3)所得的发酵液后处理后，得到胶原蛋白；
[0046] 后处理包括离心去菌体、缓冲液抽提、盐析、离子交换、柱层析精制和冷冻干燥，细 胞经离心后获得上清液，然后加入甲酸缓冲液进行抽提，盐析粗提，用离子交换树脂吸附以 0.5mol/LNaCl、20mMTrispH8.0洗脱后，再用金属螯合柱吸附、洗脱，收集蛋白冷冻干燥， 即可获得胶原蛋白样品。
[0047]如附图1所示，混合加大诱导的蛋白产量达到了 3.3g/L，而单一诱导剂诱导的蛋白 产量为2.77g/L，提高了 19.1 %，而诱导剂加低温诱导蛋白产量最低，不足2.5g/L。
[0048] 如附图2所示单纯诱导剂诱导、诱导剂加低温诱导和本发明的混和诱导的甲醇利 用率分别为7.5X10-3L/(h.L)、6.1X10-3L/(h.L)和 8.33X10-3L/(h.L)，混合诱导较传统的 单纯诱导剂诱导甲醇的利用率提高了 9.96%。
[0049] 实施例2
[0050] 本发明胶原蛋白的分阶段混合诱导发酵方法，包括以下步骤：
[0051] (1)菌种的纯化与保藏、活化与扩培；
[0052] (2)摇瓶、种子罐的种子培养；
[0053]挑取单菌落接入摇瓶，在温度为30°C，转速为220rpm的条件下培养24h，然后接入 种子罐，接种量为3%，接种前，每升培养基加入4.35ml无菌PTM1 (微量兀素盐）；接入摇瓶发 酵液，接入前需每瓶做镜检，温度为30°C，pH为5.0，设起始转速300rpm，空气通气量1.0L/ (L·min)，罐压为0.05MPa，通气量为1.0L/(L·min)，每4h，无菌取样测0D600、湿重、镜检纯 度，经过5-8h的迟缓期之后，菌体开始生长，溶氧开始下降，待溶氧下降至18%开始提高搅 拌转速，每次提高50rpm，一直提高到650rpm，维持溶氧在20 %，培养24h，生物量达到50g/L， 移入发酵罐。
[0054] (3)发酵罐内菌体培养与甲醇驯化、初始诱导阶段与混合加大诱导阶段；
[0055] 发酵罐内菌体培养：
[0056]配FBS培养基，校正pH电极，校正溶氧电极，灭菌，降温到30°C，注意水分蒸发损失。 插入补料瓶:氨水瓶、消泡剂瓶。补料50 %的甘油、甲醇;校正蠕动栗，精确计量进样体积;设 置转速300rpm，空气通气量1.0L/(L·min)，温度为30°C，pH为5.0，温度自动控制；与氨水栗 级联控制，并开始校正培养基pH;接种前，每升培养基加入4.35ml无菌PTM1 (微量元素盐）； 按照8%的接种量，将菌种从种子罐移入发酵罐，接入前需做镜检。随着菌体对甘油的消耗， 待溶氧下降至18%_22%，提高搅拌转速为600rpm，，使溶氧控制在20%-40%，待甘油耗尽， 溶氧回升到100%以后，流加甘油速度12.9ml/h/L，维持溶氧在18%-22%，此时生物量逐渐 积累，待生物量积累到细胞湿重应达到200g/L时，停止流加甘油，保持40min，然后进入甲醇 驯化过程。
[0057]甲醇驯化阶段：
[0058]第一阶段在发酵罐中加入甲醇，使发酵罐内甲醇浓度为0.3%，随后溶氧会急剧下 降，当下降至16%-20%，溶氧又会产生回升，回升至40%-45%，然后维持llmin恒定，之后 溶氧又继续下降，下降幅度为8%-12%，然后溶氧急剧的上升，此时说明第一次加入的甲醇 已完全消耗殆尽，此阶段时长为3-4h;
[0059]第二阶段加入甲醇使发酵罐内甲醇浓度达到0.5%，溶氧立即下降至15 %-20%， 维持3h，然后溶氧立马回升，说明此阶段加入的甲醇已完全消耗殆尽，可进入初始诱导阶 段。
[0060]初始诱导阶段：
[0061]此阶段首先调节发酵罐温度为28°C，流加甲醇，采用蠕动栗，蠕动速率为1/7,即每 七秒周期内运转一秒，流加速率为3.95ml/h/L，以控制溶氧在18 %-22 %，设置转速为 650rpm，通气流量为1L/(L·min)，罐压为0.05MPa并保持不变，此时，菌体生物量会不断增 加，待生物量达到250g/L时，作为此阶段的结束，本阶段总诱导时长为20-25h，随后可进入 混合加大诱导阶段。
[0062]混合加大诱导阶段：
[0063]此阶段调节发酵罐温度由28°C降为25°C，创造低温环境，调整通气量由1L/(L·min)提高至1.3L/(L·min)，罐压升高至0.070.09MPa，为发酵提供高动力，此时溶氧升高， 加大甲醇的流加速率至9.30ml/h/L以维持18 %-22 %的溶氧，一直维持到发酵结束，菌体湿 重维持恒定或下降幅度超过20g/L作为发酵结束的标准，此阶段维持时间在40-50h，菌体湿 重最终可达270g/L，蛋白产量可达3.lg/L。
[0064] (4)将步骤(3)所得的发酵液后处理后，得到胶原蛋白；
[0065]后处理包括离心去菌体、缓冲液抽提、盐析、离子交换、柱层析精制和冷冻干燥，细 胞经离心后获得上清液，然后加入甲酸缓冲液进行抽提，盐析粗提，用离子交换树脂吸附以 0.5m〇VL的NaCl、20mMTrispH8.0洗脱后，再用金属螯合柱吸附、洗脱，收集蛋白冷冻干 燥，即可获得胶原蛋白样品。
【主权项】
1. 一种胶原蛋白的分阶段混合诱导发酵方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 菌种的纯化与保藏、活化与扩培； (2) 摇瓶、种子罐的种子培养； (3) 发酵罐内菌体培养与甲醇驯化、初始诱导阶段与混合加大诱导阶段； 甲醇驯化过程为： 第一阶段加入甲醇，使发酵罐溶氧下降至16%_20%，维持时间3-4h，之后溶氧回升;第 二阶段加入甲醇，使发酵罐内溶氧下降至15 % -20 %，维持时间2-3h; 初始诱导阶段过程为： 调节发酵罐内的温度为28°C，采用间歇式恒速流加甲醇，控制溶氧在18%-22%，设置 搅拌转速为650rpm，流量为1IV(L · min)罐压为0.05MPa并保持不变，待生物量达到240-260g/L时此阶段结束； 混合加大诱导阶段为： 调整发酵罐内温度为25°C，将通气流量由1L/(L · min)提高至1.3L/(L · min)，罐压升 高至0.07MPa-0.09MPa，加大甲醇的流加速率以维持18 % -22 %的溶氧，一直维持到发酵结 束，菌体湿重维持恒定或下降幅度超过20g/L，此阶段结束； (4) 将步骤(3)所得的发酵液后处理后，得到胶原蛋白。2. 根据权利要求1所述的胶原蛋白的分阶段混合诱导发酵方法，其特征在于，所述甲醇 驯化过程中第一阶段发酵罐内控制甲醇的浓度为0.3%，第二阶段发酵罐内控制甲醇的浓 度为0.5%。3. 根据权利要求1所述的胶原蛋白的分阶段混合诱导发酵方法，其特征在于，所述种子 罐的种子培养基和发酵罐内菌体培养基为改良后的FBS培养基，其配方为： 货油 4% CaSQ4 0.093% I2SO4 1.82% MgSO4-TH2O 1.49% PTMl (微量元素盐） 0.435% KILPO4 5.35% 其余为水。4. 根据权利要求1所述的胶原蛋白的分阶段混合诱导发酵方法，其特征在于，所述初始 诱导阶段采用间歇式恒速流加甲醇，流加速率是3.55-3.95ml/h/L。5. 根据权利要求1所述的胶原蛋白的分阶段混合诱导发酵方法，其特征在于，所述混合 加大诱导阶段甲醇的流加速率为9.0-9.30ml/h/L。
【专利摘要】本发明公开了一种胶原蛋白的分阶段混合诱导发酵方法，属于蛋白工程技术领域，菌种的纯化与保藏、活化与扩培；摇瓶、种子罐的种子培养；发酵罐内菌体培养与甲醇驯化、初始诱导阶段与混合加大诱导阶段；发酵液后处理后，得到胶原蛋白。本发明采用诱导剂、低温、高动力的混合加大诱导模式，与用单一阶段添加诱导剂进行诱导相比，菌体对碳源甲醇有更好的适应过程，生物量得到了进一步的积累，循序渐进，逐渐加大诱导强度，目标蛋白的产量大量提高；与单一用温度诱导的方式相比，保证了目标胶原蛋白的正确折叠，同时提高动力条件满足了菌体在诱导表达阶段对溶氧的大量需求，提高了目标胶原蛋白的表达产量，同时又不会造成菌体中毒现象的发生。
【IPC分类】C12N1/36, C12N1/16, C12R1/84, C12P21/02
【公开号】CN105420320
【申请号】CN201510999372
【发明人】金伟
【申请人】山东鲁抗医药股份有限公司
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月28日