物是根据0STC基因 （gene bank Accession:ΝΜ_001006442·1)用primer premier 5设计 得到的。第一对引物根据common区域进行设计，用于扩增common区域的Proximal片段;第二 对引物根据Extended区域进行设计，用于扩增Extended区域的Distal片段。两对引物由 invitrogen公司合成。
[0030] 表1、引物序列表
[0031]
[0032]检测0STC基因 mRNA的可变腺苷酸位点使用情况的方法，包括以下步骤：
[0033] S1、提取样品总RNA，逆转录得到cDNA
[0034] 用1 X 105pfu Md5(Marek，s disease virus Md5，MDV Md5)感染单层CEF细胞（鸡 胚成纤维细胞），以不感染的CEF细胞为对照，分别收集18h、36h、54h、72h后的细胞，提取总 RNA;消化DNA后，检测0D260/280，比值在2.0-2.1为合格。采用常规方法对合格的总RNA进行 逆转录，得到cDNA。
[0035] S2、qPCR
[0036] 使用第一对引物以cDNA为模板qPCR扩增common区域的Proximal片段，其CT值记为 (^值^;以cDNA为模板，使用第二对引物扩增Extended区域的Distal片段，其CT值记为CT 值dis;计算CT值dis与(^值#。的比值。
[0037] 其中，qPCR反应体系如下： cDNA 模板 lpL:， 2xqPCR N4aster Mix 5pL，
[0038] 上游引物 0.25pL， 下游引物 0.25μΕ， 无核酸酶水 至1 ΟμΙ。
[0039] qPCR反应条件如下：
[0040] 预变性:95°Clmin;扩增:95°C5s，62°C15s，72°C10s信号收集，40个循环;溶解曲 线:95°Clmin;冷却:37°Clmin。
[0041 ] 如图1所示，用0STC-short_F、0STC-short-R这对引物扩增的proximal片段反映的 是较为近端的3 'UTR isoform的表达情况，proximal片段扩增的量可以反映总的3'UTR isoform的量;而相应的用0STC-long_F、0STC-long-R扩增的distal扩增片段是远端的3' UTR isoform的表达情况，distal片段扩增的量可以反映长的3'UTR isoform的表达量。因 此，CT值dis/CT值pr。可以反映样品中该基因3 'UTR isoform的使用情况:CT值dis/CT值pr。越小 则说明样品中使用短的3 ' UTR isoform越多，相应地，CT值dis/CT值pr。越大则说明样品中使 用长的3'UTR isoform越多。因此，通过qPCR的CT值比较可获得IFF01的可变腺苷酸位点的 使用情况。
[0042] 通过计算可知，对照组的CT值dis/CT值pr。平均值为0.64,感染病毒组的CT值dis/CT 值@。平均值为0.75。相对于对照组，感染病毒组可变腺苷酸位点的使用明显偏向使用远端 的3 ' UTR，与实施例1的结果相符。
[0043]实施例3、动物实验
[0044] 以2000pfu Md5感染一日龄小鸡十只，30天后采集感染Md5鸡只全血，同时采集十 只未感染MDV的鸡只全血，分别从血液中分离淋巴细胞作为样本，进行0STC基因 mRNA的可变 腺苷酸位点使用情况检测，检测方法与实施例2相同。本实施例中对照组的CT值dis/CT值pr。 平均值为〇. 6，感染病毒组的CT值。平均值为0.71，结果与实施例2-致。所以，0STC 基因多聚腺苷酸化位点的使用情况可作为鸡感染MDV的一个生物标记。
[0045]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保 护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种检测OSTC基因 mRNA的可变腺苷酸位点使用情况的引物，其特征在于，所述引物 包括第一对引物和第二对引物，其序列与0STC基因 3'非翻译区中的两对序列或其互补序列 相同。2. 根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述第一对引物的序列与0STC基因 3'非翻 译区中common区域的部分序列或其互补序列相同，所述第二对引物的序列与0STC基因 3'非 翻译区中Extended区域的部分序列或其互补序列相同。3. 根据权利要求2所述的引物，其特征在于，所述第一对引物用于扩增common区域的 Proximal片段，所述第二对引物用于扩增Extended区域的Distal片段。4. 根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述第一对引物的序列如SEQ ID NO: 1-2 所示或其互补序列，所述第一对引物的序列如SEQ ID N0:3-4所示或其互补序列。5. -种检测0STC基因 mRNA的可变腺苷酸位点使用情况的方法，其特征在于，包括以下 步骤： 提取样品总RNA，逆转录得到cDNA; 以cDNA为模板，使用第一对引物qPCR扩增common区域的Proximal片段，得到CT值pr。； 以cDNA为模板，使用第二对引物扩增Extended区域的Distal片段，得到CT值dis; 计算CT值dis与(^值#。的比值。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一对引物的序列如SEQ ID NO: 1-2 所示或其互补序列，所述第一对引物的序列如SEQ ID N0:3-4所示或其互补序列。7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述qPCR的反应体系为： cDNA 模板 1#L， 2xqPCR Master Mix 5μL, 上游引物 0.25μΙ.， 下游引物 0.25,uL， 无核酸酶水 至ΙΟμΙ-8. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述qPCR的反应条件为： 预变性:95°Clmin;扩增:95°〇58,62°(3158,72°(3108信号收集，40个循环;溶解曲线 :95 〇ClminJ4^|3:37〇Clmin〇
【专利摘要】本发明公开了检测OSTC基因mRNA的可变腺苷酸位点使用情况的引物及方法。所述引物包括第一对引物和第二对引物，其序列与OSTC基因3’非翻译区中的两对序列或其互补序列相同。所述方法包括以下步骤：提取样品总RNA，逆转录得到cDNA；以cDNA为模板，使用第一对引物qPCR扩增common区域的Proximal片段，得到CT值pro；以cDNA为模板，使用第二对引物扩增Extended区域的Distal片段，得到CT值dis；计算CT值dis与CT值pro的比值。本发明OSTC基因mRNA的可变腺苷酸位点使用情况的检测方法方便快捷，适合在条件简陋的实验室以及发展中国家得到进一步推广。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105441564
【申请号】CN201511033760
【发明人】曹永长, 薛春宜, 李 杰, 何亮亮
【申请人】中山大学
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年12月31日