细胞，我们制备了 HER2^及 HER+MCF7细胞。利用具有'非沉默'序列(NS)、具有衰减HER2表达的'短发夹'序列（sh)的载 体以及利用具有HER2基因的载体转染MCF7细胞。图2显示了利用蛋白质印迹法的在多种亚 系中HER2蛋白的表达。在随后研究中，使用亚系NS、Shl26(克隆26)及+11(克隆11)。
[0135] 实施例9
[0136] 我们评价了TAX及MitoTAX对于多种乳腺癌细胞系的IC5Q值。由利用结晶紫方法的 产生的在多个浓度的两种物质下的细胞存活曲线确定单独各值。我们使用具有多种各种 HER2 及 ERa 蛋白水平的细胞系：ERa+/HER2低(MCF7鉢）、ERa+/HER2+(MCF7HER2 +、BT474、NeuTL-乳 腺癌的鼠系）、ERa+/HER2-(MCF7her2-、T47D、ZR75-1)、ERa-/HER2+ (SK-BR-3)、ERa-/HER- (MDA-1^-231、]\0^-]\?-453、]\0^-]\?-436)。从表1，可清楚看出，]^切了4乂的1〇5()值明显低约一个数量 级。最敏感的是具有ERa+/HER2+基因型的MCF7her2+亚系。具有ERa+/HER2- (MCF7her2-)及ERa+/ HER2?基因型(MCF7隸)的相应系的特征在于约两倍大的IC5Q值，其指出这个事实:HER2蛋白 水平增加导致对Mi toTAX的敏感性增加。另一方面并与Mi toTAX相反，高HER2细胞对TAX的敏 感性降低。这表明了尚未对任何其它抗癌物报道的MitoTAX的独特性质(据我们所了解）。
[0137] 表1.具有不同HER2及ERa蛋白表达的乳腺癌细胞系的IC5Q值(μΜ)。
[0138]
[0139] 实施例10
[0140] 我们也研究了MitoTAX是否抑制肿瘤生长。利用转基因小鼠种系FVB/N c-neu测试 MitoTAX的抗癌效力，该转基因小鼠种系FVB/N c-neu出生时不带肿瘤且在成年时的特征为 因雌激素作用导致的HER2蛋白表达的增加 （Guy CT等Expression of the neu protooncogene in the mammary epithelium of transgenic mice induces metastatic disease.Proc Natl Acad Sci USA 1992;89:10578-10582·)。这些小鼠发育不良，随后在 出生后3至4个月时，乳腺区增生并在6个月后形成可触知的肿瘤。重要的是，这在功能性免 疫系统的情况下发生。此乳腺癌(乳腺)模型非常接近'原位导管'类型的具有高HER2蛋白水 平的人乳腺癌。我们的结果（图3)表明MitoTAX对这些肿瘤的生长具有很好的效力。向小鼠 施用3μπιο1 TAX及0.5ymol MitoTAX的剂量，每周两次，持续两周。利用超声成像定量肿瘤的 体积，超声成像可以高精确度及以非侵入方式看到肿瘤，包括嵌埋部分。清楚了解到显然， MitoTAX比TAX有效约20至30倍，这两种制剂的作用之间的差异是高度显著的。符号表示 处理动物与参照动物之间的显著差异，符号'**'表示经TAX处理的动物与经MitoTAX处理的 那些动物之间的显著差异。在试验动物中没有看到明显毒性。曲线下方的照片表明来自各 动物组的代表性肿瘤。
[0141] 实施例11
[0142] MitoTAX的一个重要方面是其对具有增加的HER2癌基因表达的细胞系的更高的抑 制生长的活性。这在图4中显示，这也证实具有降低的HER2癌基因表达的细胞系(克隆26)对 Mi toTAX应答较小，而这与TAX正好相反。对于这些试验，我们也通过将亲本MCF7细胞长期暴 露于剂量逐步增加的TAX制备耐受TAX的MCF7亚系。可看出，耐受TAX的这些细胞对MitoTAX 敏感(图4)。图4中结果说明从MCF7细胞衍生的具有如下不同基因型的乳腺癌亚系的存活率 (ERa+/HER2 低、MCF7 隸;ERa+/HER2+，MCF7HER2+-克隆 26; ERa+/HER2-，MCF7HER2--克隆 11; ERa+/ 册1?2气10^^)。利用结晶紫方法得到这些结果，该结晶紫方法可在各种浓度的組丨(^父及 TAX存在下，区别活细胞与死细胞。
[0143] 实施例12
[0144] 引起癌细胞死亡的抗癌物质的一个重要特征是细胞死亡模式。为此，我们测试了 Mi toTAX是否引起细胞凋亡，即当细胞以控制方式死亡并在不发生炎症反应下，通过吞噬细 胞将其残余凋亡体从组织中去除时的程序性细胞死亡。图5显示制剂的确引起细胞凋亡。基 于利用流式细胞仪评价在质膜外部中具有膜联蛋白V的细胞的百分比评价细胞凋亡。再一 次，结果证明Mi toTAX对具有高HER2蛋白的细胞的效力增加，而具有低HER2蛋白水平的细胞 更耐受(但是仍发生细胞凋亡）。
[0145] 实施例13
[0146] 先前出版物（Moreira PI等Tamoxifen and estradiol interact with the flavin mononucleotide site of complex I leading to mitochondrial failure.J Biol Chem 2006;281:10143-10152.)指出在高水平的制剂下，TAX在线粒体中的标靶为复 合物I。我们发现，对于MitoTAX也同样如此，如图6中证实。此也证实TAX (左)及MitoTAX (右） 通过线粒体复合物I及Π 对呼吸的抑制性作用。可看出，TAX在浓度超出20μΜ时，与复合物 Π 相比，优先抑制复合物I。与复合物Π 相比，MitoTAX也优先抑制复合物I，但是在约1至2μΜ 的显著更低的浓度下。对于这些测定，将MCF7细胞置于Oxygraf仪器的室内并在TAX(左)及 MitoTAX(右)剂量增加下确定呼吸。呼吸(与ATP形成相关的耗氧量)与106个细胞相关，并被 显示为一个相对值，其中起始水平的呼吸被标示为相对值1。
[0147] 实施例14
[0148] -般与多种靶向线粒体的抗癌物相关的性质为它们提高氧化应激(形成活性氧种 类，R0S)的能力，选择性地在癌细胞中，尤其与它们对参与氧化磷酸化的线粒体复合物的作 用相关。此通常与线粒体电势降低相关(Neuzil J等Classification of mitocans,anti-cancer drugs acting on mitochondria.Mitochondrion 2013；13:199-208.Kluckova K ^Mitochondrial complex 11, a novel intriguing target for anti-cancer agents · Biochim Biophys Acta 2013; 1827:552-564 .)。我们也测试了对于MitoTAX的R0S 的形成。图7显示了在暴露于TAX或MitoTAX (都在5μΜ下）1小时后，具有不同HER2水平的MCF7 亚系的R0S的生成。可看出，在相同浓度下，TAX明显比MitoTAX效力更低。另一个重要发现是 MitoTAX在具有高HER2水平的细胞中引起更多R0S形成，而在具有低HER2的细胞中产生较少 ROS^AX则不按照这个趋势。在所有情况中，线粒体呼吸的解偶联剂(CCCP)降低线粒体的电 势到其基值。图8显示了MitoTAX(而非TAX)在5μΜ浓度下并在1小时内降低线粒体电势。
[0149] 实施例15
[0150] 在具有高HER2蛋白水平的乳腺癌细胞中，蛋白优先地位于线粒体中。如图9中所 示，其中显示了初始细胞系MCF7以及亚系HER2+MCF7(克隆11)、HER2_MCF7(克隆26)的蛋白质 印迹，其中可看出，实际亚系耐受TAX(克隆TAM-R)。可看出，克隆11细胞的特征在于HER2蛋 白（箭头指示)在线粒体部分、细胞质部分(其含有质膜)及细胞核部分中的表达增加。下图 显示了当膜暴露更长时间时的线粒体部分，以可清楚看出，在线粒体中，虽然在明显更低水 平下，但是HER2蛋白也存在于亲本MCF7细胞以及耐受TAX的细胞中，而不存在于具有低HER2 的细胞中（克隆26)。这出人意料的结果与目前公布的研究一致（Ding Y等Re cep tor tyrosine kinase ErbB2translocates into mitochondria and regulates cellular metabolism.Nat Commun 2012;3:1271)。此公布也显示了具有主要位于线粒体的HER2蛋白 的高表达的乳腺癌细胞耐受曲妥单抗(trastuzumab)。在将曲妥单抗(trastuzumab)施用于 癌细胞期间，更多HER2蛋白移向线粒体（Ding Y等Receptor tyrosine kinase ErbB2 translocates into mitochondria and regulates cellular metabolism.Nat Commun 2012;3:1271.)。乳腺癌细胞可使HER2蛋白远离其表面(质膜)移动，以使蛋白不受曲妥单抗 (trastuzumab)影响。一个HER2抑制结果是p27蛋白的活化，此为细胞周期的抑制剂，降低细 胞的恶性性质（Yang HY，Shao R, Hung MC, Lee MH.p27 Kipl inhibits HER2/neu_ mediated cell growth and tumorigenesis.Oncogene 2001;20:3695-3702·)。因为癌细 胞以进化的方式程序化以保持高增殖状态，所以这对具有高HER2蛋白水平的癌细胞具有不 利影响（Hanahan D,Weinberg RA.The hallmarks of cancer.Cell 2000; 100:57-70)。因 此，我们可推测到，因为曲妥单抗(trastuzumab)的标靶-HER2蛋白不大量存在于膜中，所以 细胞获得对曲妥单抗(trastuzumab)的耐受。但是，在此过程期间，将增加其对MitoTAX的敏 感性，Mi toTAX可渗入线粒体中，这进一步突出其特殊性质。
[0151] 实施例16
[0152] 具有高HER2蛋白的乳腺癌细胞的敏感性增加的一个原因是它们改变的线粒体生 物能及形态。线粒体中高水平的HER2蛋白改变它们的形态及功能。图10显示了HER2+细胞 (克隆11)中的线粒体比HER2_细胞(克隆26)中的那些线粒体短约两倍。借助于经靶向线粒 体的GFP蛋白转染的细胞系的共焦显微镜检查评价线粒体长度（通过绿色荧光看到线粒 体）。通过利用Fuji Freehand Lines测量工具软件分析以随机方式选择的50个细胞中的线 粒体来确定长度。这与线粒体呼吸减弱相关并与线粒体电势降低以及乳酸盐产生增加(移 向有氧糖酵解代谢的征兆)有关（图11)。在此情况中，表现出，具有高HER2蛋白水平的细胞 产生比亲本细胞及具有低HER2蛋白水平的细胞约两倍多的乳酸盐。在呼吸的情况中，恰好 相反。具有高HER2蛋白水平的细胞呼吸更弱(ATP产生与耗氧量降低有关）。以高HER2蛋白水 平为特征的细胞的糖酵解在ATP产生中的更高份额也与它们的葡萄糖摄取增加有关（图 12)〇
[0153] 实施例17
[0154] 具有高HER2蛋白水平的HER2+细胞对MitoTAX的敏感性增加的另一个可能的原因 是这个制剂对雌激素受体ERa的影响，ERa具有抗凋亡作用（Thomas C，Gustaffson J.The different roles of ER subtypes in cancer biology and therapy.Nat Rev Cancer 2011 ； 11:597-608.Deblois D,Giguere V.Oestrogen-related receptors in breast cancer