高纯度雷迪帕韦中间体的制备方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及医药技术领域，具体地涉及一种雷迪帕韦中间体，高纯度（1R，3S，4S)-N-叔丁氧羰基-2-氮杂双环[2.2.1 ]庚烷-3-羧酸的制备方法。
【背景技术】
[0002] 2014年，吉拉德公司开发出的复方制剂雷迪帕韦/索非布韦复方(商品名Harvoni) 在美国上市，这种药物主要适用于基因I型慢性丙肝感染。
[0003]其中，（1R，3S，4S)-N-叔丁氧羰基-2-氮杂双环[2.2.1 ]庚烷-3-羧酸是雷迪帕韦 (Ledipasvir)的关键中间体。该化合物的CAS登记号291775-59-2，具体结构式如下：
[0005]目前，已有专利W02011/091532A1、W02012/040923A1 和US2013/0287731A1 报道了 该雷迪帕韦中间体的合成方法，上述专利主要公开了下述两条合成路线：
[0007] 其是将制备得到的（lR，3S，4S)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羧酸乙酯或（11?，35， 4S)-N-叔丁氧羰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羧酸乙酯经LiOH或盐酸水解，最终得到雷 迪帕韦中间体(11?，35,45)-~-叔丁氧羰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羧酸。
[0008]通常，中间体纯度越高，得到高纯度的终产物越容易，生产成本越低。但是，目前并 没有文献报道如何制备得到高纯度的雷迪帕韦中间体。
【发明内容】
[0009]针对上述问题，本发明提供了一种高纯度雷迪帕韦中间体（1R，3S，4S)-N_叔丁氧 羰基-2-氮杂双环[2.2.1 ]庚烷-3-羧酸(VI)的制备方法，其特征在于:包括以下步骤：
[0011]将式（V)化合物溶解在含水的溶剂中，加入能水解酯键的酶组成反应溶液，水解， 分离纯化得到式(VI)化合物；
[0012]其中，R表示的烷基。所述(^~〇5的烷基是指具有1~6个碳原子的直链或支 链的烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、戊基、辛基等等。 [0013]进一步地，R选自甲基或乙基。在本发明一种具体的实施方式中，R选自甲基。
[0014]进一步地，作为反应的原料，所述式(V)化合物的非对映异构体过量不低于70%; 更进一步地，所述式(V)化合物的非对映异构体过量不低于80%。
[0015] 进一步地，所述酶选自水解酶。所述"水解酶"指的是在国际酶学委员会(Ezyme Committee，EC)的分类系统下，催化反应类型为水解反应的酶类，即隶属于EC3的酶类。
[0016] 更进一步地，所述水解酶选自酯水解酶或蛋白酶。所述"酯水解酶"指的是在国际 酶学委员会的分类系统下，在水解酶大类下，按照水解键的类型，水解的键为酯键的酶类， 即隶属于EC3.1的酶类。所述"蛋白酶"指的是在按照酶作用的底物进行分类的分类系统 下，可以催化水解蛋白质的酶类。通常情况下，由于这类酶作用于肽键的专一性和活性较 高，在EC分类系统中，隶属于EC3.4的酶类。然而本领域公知的，许多酶具有多种催化活性， 也存在能水解酯键的蛋白酶，例如木瓜蛋白酶在该分EC分类系统中的编号是EC3.4.22.2， 其也能水解酯键。在本发明具体的实施例中，也有多种蛋白酶体现出了水解酯键的活性。
[0017] 当水解酶选自酯水解酶时，更进一步地，所述酯水解酶是羧酸酯水解酶。所述"羧 酸酯水解酶"指的是在国际酶学委员会的分类系统下，在水解酶大类下，按照水解键的类 型，水解的键为酯键，酯键具体为羧酸酯碱的酶类，即隶属于EC3.1.1的酶类。
[0018] 更进一步地，所述脂肪酶选自猪胰脂肪酶、LipozymeTL100、LipozymeTLIM、 LipozymeCALBL、牛胰脂肪酶或诺维信435脂肪酶中的一种或几种。
[0019] 其中，优选地，所述脂肪酶选自猪胰脂肪酶或诺维信435脂肪酶。
[0020] 当水解酶选自蛋白酶时，进一步地，所述蛋白酶选自胃蛋白酶、中性蛋白酶、碱性 蛋白酶、rTrypsin、木瓜蛋白酶或α-糜蛋白酶中的一种或几种;优选α-糜蛋白酶。
[0021 ]进一步地，所述含水的溶剂选自水或磷酸盐溶液，或选自水或磷酸盐溶液与下述 有机溶剂的混合溶液:乙醇、丙酮、四氢呋喃或1，4_二氧六环;所述磷酸盐溶液是ρΗ=8的磷 酸盐缓冲溶液;所述混合溶液中，水或磷酸盐溶液与有机溶剂的体积比为1:1~1.5。
[0022]更进一步地，所述溶剂中还含有有机碱，所述有机碱选自三乙胺、二异丙胺、叔丁 胺或Ν-甲基吗啉中的一种或几种。
[0023]更进一步地，所述溶剂为仅含有三乙胺的水溶液。更进一步地，所述水与三乙胺的 体积比为30:1~100:1。更进一步地，所述水与三乙胺的体积比为40:1~50:1。
[0024]进一步地，所述式(V)化合物与溶剂的质量体积比为1:12.5~1:25。更进一步地， 所述式(V)化合物与溶剂的质量体积比为1:18~1:20。
[0025] 进一步地，所述酶与式(V)化合物的质量比为1:50~1:200。更进一步地，所述酶与 式(V)化合物的质量比为1:100~1:120。
[0026] 进一步地，所述反应的温度为25°C~70°C。更进一步地，所述反应的温度为45°C~ 55°C，优选 50°C。
[0027] 进一步地，所述反应的时间为5h~120h。更进一步地，所述反应的时间为24h~ 48h，优选 24h。
[0028]进一步地，所述分离纯化的方法如下：用低极性有机溶剂萃取反应液，取水相，加 入低极性有机溶剂，降温至〇_l〇°C，调pH= 1-4，取有机相，浓缩析晶，过滤干燥即得；
[0029] 所述低极性有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、醋酸异丙酯或甲基异丁酮。 在本发明具体的实施例中，调pH=2，低极性有机溶剂选自二氯甲烷。
[0030] 进一步地，所述析晶的温度为0°C_50°C。更进一步地，所述析晶的温度为5°C_20 V。
[0031]进一步地，所述式（V)化合物具有化合物3所示的结构：
[0033]所述化合物3是通过下述路线制备得到的：
[0035]化合物1在甲醇中经还原、脱苄基得到化合物2,化合物2与二碳酸二叔丁酯反应， 得到化合物3。
[0036]本发明方法可用于下述路线的雷迪帕韦中间体制备：
[0038]在通常的实施方式中，包括以下步骤：
[0039] (1)化合物1在甲醇中经还原、脱苄基得到化合物2,化合物2与二碳酸二叔丁酯反 应，得到化合物3,非对映体纯度(de)为80-86%。化合物3中含有7-10%的非对映异构体杂 质。
[0040] (2)按照本发明的酶催化方法，以步骤（1)中得到的化合物3为原料制备得到雷迪 帕韦中间体。
[0041]发明人在前期研究中发现，按照现有的方法在制备得到（1R，3S，4S)-N_叔丁氧羰 基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羧酸的同时，还有少量的非对映异构体杂质生成(7-10%)， 该非对映异构体杂质的结构式及其结构表征如下所示：
[0043]质谱：MS(M+H+):m/z240.1:?MMR(400MHz，DMS0-d6):Sl2.51(s, 1H),4.17-4.16 (d,lH),4.05-4.03(d,lH),2.68(s,lH),1.59-1.47(m,5H),1.42-1.39(m,4H),1.32(s,6H)〇 而目标产品的（1R，3S，4S) -N-叔丁氧羰基-2-氮杂双环[2.2.1 ]庚烷-3-羧酸氢谱为:4NMR (400MHz，DMS0-d6)Jl2.47(s，lH)，4.12-4.05(d，lH)，3.60(s，lH)，2.58(s，lH)，1.73-1.38 (m，5H) ,1.31 (s，4H)，1.25(s,5H), 1.23-1.20(t，lH)，两者差异明显。
[0044]发明人用常规的结晶方法纯化含有上述非对映异构体杂质的雷迪帕韦中间体，发 现很难将该杂质的含量降低至0.5%以下，而且收率也较低。如果该杂质在这个中间体中不 能有效控制，该杂质最终会以原料药的非对映异构体的形式传递到原料药中，难以除去，影 响了最终产品雷迪帕韦的质量。
[0045]可见，现有报道的方法