测 定菌株的生长曲线。
[0043]测定方法:各从斜面挑一环菌到装有50mL YPX液体培养基(20g/L木糖，20g/L蛋白 胨，10g/L酵母浸粉）的250mL的摇瓶里，30°C，180rpm条件下培养，定时取样，适当稀释， 600nm下测定0D值。测定结果如图2所示。
[0044]从图2可以明显看出，温度在30°C_41°C之间，虽然随着温度的提高，菌株的生长受 到了不同程度的抑制，但仍可明显看出，U1-58突变株的生长性能与出发菌株相比均有一定 程度的提高，可见该突变菌株的温度耐受性优于出发菌株。
[0045] 实施例3:不同温度下U1-58突变株木糖发酵性能的测定
[0046] 以U1-58突变株和U1出发菌株互为对照，在30°(3、33°(3、35°(3、37°(3、39°(3和41°(3测 定菌株的木糖发酵性能。
[0047] 发酵条件及发酵液中代谢物浓度的测定均同实施例1(2)。以发酵结束发酵液中残 余木糖浓度、乙醇浓度以及相应糖醇转化率为指标进行分析，发酵结果如图3所示。
[0048]如图3所示，在各温度下U1-58突变株与U1出发菌株相比，乙醇浓度显著提高，残糖 浓度明显降低，相应糖醇转化率也有一定程度的增加。在30°C、33°C、35°C、37°C、39°C、41°C 时，Ul-58突变株乙醇浓度与U1出发菌株乙醇浓度相比较，分别提高了 13.69%、27.06%、 42.29%、72.05%、89.15%、166.31 %。可见，U1-58突变菌株的木糖发酵能力在各温度均优 于U1出发菌株，且随着温度的升高，U1-58突变株与出发菌株相比，发酵木糖产乙醇能力的 差距越来越大，也证实了 U1-58突变株的温度耐受性优于U1出发菌株。
[0049] 实施例4. U1-58突变株玉米芯酶解液发酵
[0050]以U1-58突变株和U1出发菌株互为对照，进行玉米芯酶解液发酵。发酵过程中定时 取样，用高效液相色谱法测定发酵液中葡萄糖、木糖、甘油、木糖醇和乙醇的浓度。发酵过程 中各物质浓度变化，如图4所示。
[0051 ] 发酵过程如下：
[0052]木质纤维素酶解液的制备:将玉米芯与柠檬酸缓冲液按固液比1:5投料，纤维素酶 添加量20FPU/g玉米芯，木聚糖酶添加量12000U/g玉米芯，温度50°C，摇床转速150rpm，酶解 48h，抽滤，除去滤渣，得到酶解液。
[0053]发酵培养基组成为:木质纤维素酶解液(葡萄糖(73±0.5)g/L，木糖(45±0.5)g/ L)，酵母浸粉22g/L，K2HPO42 · 5g/L，MgS〇4〇 · 1 g/L。115°C下灭菌20min。
[0054] 发酵条件:装液量50ml/250ml，初始菌种0D6Q() 5.0，转速120rpm，温度33°C，初始pH 5.0,发酵时间为120h。
[0055] 如图4所示，U1-58突变株在葡萄糖浓度降至50g/L左右开始发酵木糖，而U1出发菌 株在葡萄糖浓度降至35g/L左右才开始发酵木糖，说明在葡萄糖存在的条件下，与U1出发菌 株相比，U1-58突变株木糖发酵能力显著提高。U1-58突变株的葡萄糖消耗在60h基本发酵完 全，而出发菌株的葡萄糖消耗持续至96h，葡萄糖的更快消耗，在一定程度上加快了乙醇的 生成速率。对整个发酵过程进行数据分析，分析结果分别见表1。
[0056] 表1 U1-58突变株与U1出发菌株玉米芯酶解液发酵结果
[0058]由表1可知，U1-58突变株酶解液发酵，乙醇浓度、木糖利用率与U1出发菌株相比分 别提高38.39%、57.27% ;而木糖醇浓度与残余木糖浓度分别降低94.22%与92.58%。以上 结果表明U1-58突变株木糖发酵产乙醇的效率较U1出发菌株。结合图4,在发酵12h至60h之 间，U1-58突变株乙醇生成速率、葡萄糖消耗速率、木糖消耗速率分别达到0.50g/(L · h)、 1.05g/(L · h)、0.41g/(L · h)，分别较U1 出发菌株提高72.41%、41.89%、156.25%。此结果 表明，葡萄糖/木糖混糖发酵条件下，U1-58突变株的木糖利用效率较U1出发菌株得到了显 者提尚。
[0059] 实施例5. U1-58突变株玉米芯酶解液发酵 [0060]以U1-58突变株进行玉米芯酶解液发酵。
[0061 ] 发酵过程如下：
[0062]木质纤维素酶解液的制备:将玉米芯与ρΗ5.0的柠檬酸缓冲液按固液比1:6投料， 纤维素酶添加量40FPU/g玉米芯，木聚糖酶添加量10000U/g玉米芯，温度45°C，摇床转速 180rpm，酶解72h，抽滤，除去滤渣，得到酶解液。
[0063] 发酵培养基组成为:上述酶解液，酵母浸粉26g/L，K2HP〇4 3.5g/L，MgS〇4 0.05g/L。 115°C 下灭菌 20min。
[0064] 发酵条件:装液量50ml/250ml，初始菌种0D6Q() 3 · 0，转速150rpm，温度30°C，初始pH 5.0，发酵时间为7211。
[0065] 发酵结束后，乙醇浓度达到40.38g/L，残余木糖浓度0.58g/L，木糖利用率 98.24% .
[0066]实施例6. U1-58突变株进行玉米芯同步糖化共发酵
[0067] 将原料按一定的固液质量比投入反应器中，并向发酵培养基中加入适量营养物 质、纤维素酶、木聚糖酶、菌种，进行同步糖化共发酵。以U1-58突变株和U1出发菌株互为对 照，利用玉米芯进行同步糖化共发酵产乙醇。发酵结束后取样，用高效液相色谱法测定发酵 液中葡萄糖、木糖和乙醇的浓度，结果如图5所示。
[0068] 发酵培养基组成为:将玉米芯与梓檬酸缓冲液按固液比1: 5投料，纤维素酶添加量 20FHJ/g玉米芯，木聚糖酶添加量10000U/g玉米芯，加入NH4C1 3 · 82g/L，KH2P〇4 3 · Og/L， MgSCU 0.2g/L<3ll5°C下灭菌20min。
[0069] 发酵条件:装液量20ml/250ml，菌株初始0D6Q() 5 · 0，转速120rpm，温度33°C，初始pH 4.9，发酵时间为9611。
[0070] 如图5所示，U1-58突变株与出发菌株相比，乙醇浓度达到49.92g/L，较出发菌株提 高23.41%;总糖(纤维素+半纤维素)对乙醇的总转化率为0.42,较出发菌株总转化率提高 22.71% ;纤维素和半纤维素利用率分别达到86.12%、86.86%，较出发菌株分别高出 4.72%、12.44%。由以上可知，U1-58突变株比U1出发菌株更适于木质纤维素类原料物质发 酵产乙醇。
[0071 ]实施例7. U1-58突变株进行玉米芯同步糖化共发酵
[0072] 将原料按一定的固液质量比投入反应器中，并向发酵培养基中加入适量营养物 质、纤维素酶、木聚糖酶、菌种，进行同步糖化共发酵。以U1-58突变株利用玉米芯进行同步 糖化共发酵产乙醇。发酵结束后取样，用高效液相色谱法测定发酵液中葡萄糖、木糖和乙醇 的浓度。
[0073] 发酵培养基组成为:将玉米芯与梓檬酸缓冲液按固液比1: 6投料，纤维素酶添加量 20FHJ/g玉米芯，木聚糖酶添加量10000U/g玉米芯，加入NH4C1 2 · 87g/L，KH2P〇4 3 · 5g/L， MgSCU 0.1g/L<3ll5°C下灭菌20min。
[0074] 发酵条件:装液量20ml/250ml，菌株初始0D6Q() 8 · 0，转速150rpm，温度35°C，初始pH 4.9，发酵时间为7211。
[0075] 发酵结束后，乙醇浓度达到38.34g/L，总糖(纤维素+半纤维素)对乙醇的总转化率 为0.39，纤维素和半纤维素利用率分别达到80.65%、82.07%。
【主权项】
1. 一株高效发酵木糖产乙醇的突变株，其特征在于，所述菌株具体为为Spathaspora passalidarum U1-58,保藏编号为CGMCC No.11867。2. 利用权利要求1所述突变株进行高固液比木质纤维素酶解液发酵的方法，具体如下： (1) 按固液质量比1:4~1:6将木质纤维素原料投入pH4.5~5.5的柠檬酸缓冲溶液中， 添加纤维素酶和木聚糖酶，在45°C~55°C、150~180rpm条件下，酶解36h~72h，酶解结束， 对酶解体系进行过滤，除去滤渣，得到酶解液； (2) 以步骤(1)得到的酶解液为发酵碳源，添加其他营养物质后得发酵培养基， (3) 发酵条件：菌种初始OD600 3 · 0~6 · 0，温度30~33°C、摇床转速100~150rpm，发酵72 ~120小时。3. 如权利要求2所述的高固液比木质纤维素酶解液发酵的方法，其特征在于，所述纤维 素酶添加量为20~40FPU/g木质纤维素原料，所述木聚糖酶的添加量为10000~14000U/g木 质纤维素原料。4. 如权利要求2所述的高固液比木质纤维素酶解液发酵的方法，其特征在于，所述营养 物质为:酵母浸粉18~26g/L，K2HP〇4 1.5~3.5g/L，MgS〇4 0.05~0.2g/L。5. 利用权利要求1所述突变株进行高固木质纤维素同步糖化共发酵产乙醇的方法，具 体如下:将木质纤维素原料、柠檬酸缓冲液、纤维素酶、木聚糖酶、菌种、营养物质同时加入 生物反应器中，在温度33~35°C，摇床转速100~150rpm条件下，发酵72~96小时。6. 如权利要求2所述的高固液比木质纤维素酶解液发酵的方法或权利要求5所述的高 固液比木质纤维素酶解液发酵的方法，其特征在于，所述木质纤维素原料为玉米芯、玉米秸 杆或甜高粱中的一种。7. 如权利要求5所述的高固液比木质纤维素酶解液发酵的方法，其特征在于，所述木质 纤维素原料按固液质量比1:4~1:6投入pH4.5~5.5的柠檬酸缓冲溶液中。8. 如权利要求5所述的高固液比木质纤维素酶解液发酵的方法，其特征在于，所述纤维 素酶添加量为10~30FPU/g木质纤维素原料，木聚糖酶8000~12000U/g木质纤维素原料。9. 如权利要求5所述的高固液比木质纤维素酶解液发酵的方法，其特征在于，所述菌种 初始〇D6qq 5.0~8.0。10. 如权利要求5所述的高固液比木质纤维素酶解液发酵的方法，其特征在于，所述营 养物质为:NH4C1 2.87~3.82g/L、KH2P〇4 2.5~4.0g/L、MgS〇4 0.1 ~0.3g/L。
【专利摘要】本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一株经过诱变、筛选获得的可高效发酵木糖产乙醇的Spathaspora？passalidarum突变株及利用其进行高固木质纤维素乙醇发酵的方法。所述突变株克服了现有技术中菌株乙醇耐受性低、高固形物发酵难、利用木糖产乙醇能力差的问题，具有较高的温度耐受性、33℃下发酵木糖产乙醇浓度达到44.19g/L，利用木质纤维素水解液进行葡萄糖木糖共发酵，乙醇浓度可达到43.26g/L，高固木质纤维素同步糖化共发酵，乙醇浓度可达到49.92g/L。较现有技术取得了显著的进步。CGMCC No.1186720151211
【IPC分类】C12P7/06, C12R1/645, C12N1/16
【公开号】CN105505804
【申请号】CN201610027038
【发明人】陈叶福, 肖冬光, 付更新, 李保忠, 郭学武
【申请人】天津科技大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月15日