复合菌法提取剑麻皂素和/或海柯吉宁的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及医药原料生产领域，具体设及提取剑麻皂素和/或海柯吉宁的方法。
【背景技术】
[0002] 剑麻，又称渡萝麻、西纱尔麻、龙舌兰麻，是龙舌兰科龙舌兰属植物。据统计，2010 年末我国剑麻种植面积2.05万公顷，收获面积1.83万公顷，总产纤维4.63万吨。剑麻中干纤 维重量占全株6%左右，其他90% W上是叶汁、叶渣、麻茎、花轴。目前剑麻最主要的用途是 抽取剑麻纤维，在加工过程中会产生的大量麻渣，成为废弃物不仅造成资源浪费，而且会造 成环境污染。为了解决此问题，国内的科学研究者做了大量工作，包括从麻渣中提取剑麻皂 素(又称替告吉宁，替告皂武元)和海柯吉宁(又称海柯皂武元，番麻皂素）。
[0003] 剑麻皂素和海柯吉宁(具体结构分别如下式所示)都含有酱体骨架成分，是半合成 酱体药物的重要原料。剑麻皂素主要用于合成哺乳动物性信息素雄酱締酬和雄酱締醇，皮 质激素氨化可的松、地塞米松及倍他米松，蛋白同化激素、抗屯、律失常药、抗肿瘤药环硫雄 醇，口服避孕药双烘失碳醋，骨骼肌松弛药赃库漠锭等酱体药物。
[0004]
[0005] 龙舌兰属植物中均含有酱体皂巧元，只是含量多少不同，均可用于提取剑麻皂素 和海柯吉宁。中国专利CN1280305C公开了从剑麻或番麻中提取剑麻皂素或番麻皂素，具体 公开了将剑麻或番麻粉碎后加入水和发酵酶制剂常溫发酵后，用强酸和有机溶剂或强碱和 有机溶剂水解皂巧，酒精多次重结晶后得到剑麻皂素或番麻皂素。该方法由于用到了强酸 和强碱，不仅对设备耐酸碱要求高，而且对环境有较大污染，另外，还用到了毒性较大的有 机溶剂例如二甲苯等。中国专利申请CN103834713A利用丝状真菌发酵产生的粗酶液水解皂 巧，用氯仿或正下醇提取剑麻皂素，该方法虽然提取条件溫和，对环境污染不大，但因为不 能完全水解皂巧而产生次级巧，导致皂巧降解率低、剑麻皂素回收率低，而且由于海柯吉宁 只在C-12位比剑麻皂素多了一个酬幾基，在提取得到的剑麻皂素中，不可避免地含有海柯 吉宁，因此，不能得到纯度较高的剑麻皂素。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有的提取剑麻皂素和海柯吉宁的方法所存在的产品收率和纯度低，需 要用到强酸、强碱或者有机溶剂不仅污染环境而且毒性大，工艺复杂，成本高等问题，本发 明提供了一种复合菌法提取剑麻皂素或海柯吉宁的方法。
[0007] 本发明的发明人发现，当将不同的霉菌组合，其在发酵过程中所产生的酶能够有 效地降解龙舌兰属植物麻渣中所含有的酱体皂巧，从而无需使用强酸、强碱或者毒性大的 有机溶剂。本发明的方法提取条件溫和、成本低廉、对环境污染小、操作简单，而且能够提高 产品收率和纯度，从而使麻渣能够得到充分利用。
[0008] 本发明具体设及一种复合菌法提取剑麻皂素和/或海柯吉宁的方法，包括如下步 骤：
[0009] (1)取龙舌兰属植物或其麻渣，加水，调抑至3-6，加入果胶酶和纤维素酶，揽拌反 应后得到清液1;
[0010] (2)将菌种分别接种于培养液中，发酵结束后，将发酵液与清液1混匀，揽拌反应， 静置，去除上层清液，将下层离屯、，去除上层清液，得到沉淀物1，收集此步骤所得清液高溫 灭菌后弃去；
[0011] (3)将沉淀物1与生石灰混匀，加入75-95%的乙醇水溶液，加热回流后，加入活性 炭，回流后，离屯、，弃去沉淀，得到清液2;
[0012] (4)在清液2中加入强碱，揽拌溶解后，加入盐酸径胺，加热回流后，离屯、得清液3和 沉淀物2; W及
[0013] (5)将清液3结晶，干燥得到剑麻皂素;和/或
[0014] (6)将沉淀物2与至少85%的乙醇水溶液和0.5-1.5mol/L的盐酸水溶液混匀，回流 后，重结晶，干燥得到海柯吉宁。
[0015] 本发明的方法可W使用各种龙舌兰属植物或其麻渣来提取剑麻皂素和海柯吉宁， 优选剑麻、番麻、亚洲马盖麻、假渡萝麻、无刺番麻，最优选剑麻。本发明所使用的复合菌优 选为黑曲霉（Aspergillus niger)和米曲霉（Aspergillus oryzae)，或者为里氏木霉 (Trichorderma reesei)、米曲霉(Aspergillus oryzae)和青霉菌（Penicillium sp.)。
[0016] 本发明所使用的麻渣可W是龙舌兰属植物在抽取纤维后未干燥的麻渣，也可W是 干渣，优选干渣。麻渣可W直接使用无需粉碎，也可W在使用前被粉碎。在本发明中，优选龙 舌兰属植物或其麻渣被粉碎成粒径为0. 〇l-5cm的颗粒，更优选粒径为0.1-3畑1，最优选粒径 为约1cm。
[0017] 在步骤（1)中，优选加水量为龙舌兰属植物或其麻渣重量的0.5-25倍，更优选1-10 倍，最优选2-5倍。本领域技术人员能够理解，可W使用各种抑调节剂来调节抑，包括但不限 于巧樣酸-氨氧化钢-盐酸缓冲溶液、憐酸氨二钢-巧樣酸缓冲液或巧樣酸-巧樣酸钢缓冲液 等。一般来说，优选抑被调节至4-5,最优选约4.5。优选龙舌兰属植物或其麻渣:果胶酶:纤 维素酶的重量比为1: (0.001-0.2): (0.0005-0.1)，更优选为1: (0.005-0.1): (0.001-0.05)，最优选为1:(0.01-0.02) :(0.005-0.01)。优选反应时间为l-12h，更优选为2-化，最 优选为4-化。
[0018] 本领域技术人员可W理解，各种培养液均可用于本发明，培养液可W商购得到或 者通过本领域已知的方法自制得到。在本发明中，黑曲霉或青霉菌的培养液中含有:马铃馨 提取液 1.0L、葡萄糖20.0g、K出P〇43.0g、MgS〇4 · 7出0 1.5g、维生素 BiO.lg、琼脂 15.0g;米曲 霉培养液中含有:麦芽汁1.化、琼脂15. Og，调节抑至4.8;里氏木霉培养液含有:马铃馨提取 液1.化、葡萄糖20.Og、琼脂15.Og。优选在上述培养液中，进一步含有质量百分比为0.001-0.1 %的麻汁，进一步优选麻汁的质量百分比为0.005-0.05%，最优选为约0.01 %。优选在 本发明中，黑曲霉或青霉菌的培养液组成为：马铃馨提取液1.化、葡萄糖20.0g、K出P043 . Og、 1邑5化《7此01.5旨、维生素810.1旨、琼脂15.0旨、质量百分比为0.001-0.1%的麻汁;米曲霉培 养液组成为:麦芽汁1.化、琼脂15. Og、质量百分比为0.001-0.1 % %的麻汁，调节抑至4.8; 里氏木霉培养液组成为：马铃馨提取液1.0L、葡萄糖20.0 g、琼脂15. Og、质量百分比为 0.001-0.1%的麻汁。在上述培养液中，优选麻汁的质量百分比为0.005-0.05%，最优选为 约 0.01 %。
[0019] 在步骤(2)中，优选发酵结束后发酵液中菌量为2-50mg/mL，进一步优选为5-40mg/ mL，更优选为10-30mg/mL，进一步更优选为12-20mg/mL，最优选为约15mg/mL。在使用黑曲霉 和米曲霉的复合菌方案中，优选清液1:黑曲霉发酵液:米曲霉发酵液体积比为1:(0.5-5): (0.5-5)，更优选为1:(0.8-3) :(0.8-3),最优选为1:(1-1.5) :(1-1.5);在使用里氏木霉、米 曲霉和青霉菌的复合菌方案中，优选清液1:里氏木霉发酵液:米曲霉发酵液:青霉菌发酵液 体积比为 1:(0.5-5) :(0.5-5) :(0.1-3),更优选为 1:(0.8-3) :(0.8-3) :(0.3-1.5)，最优选 为1: (1-1.5): (1-1.5): (0.5-1)。反应溫度优选为20-60°C，更优选为30-40°C，最优选为32-37°C。反应时间优选为0.5-5天，更优选为1-3天，最优选为约2天。优选静置2-72h，更优选 24-60h，最优选约48h。优选离屯、转速为2000-8000转/min，更优选为3000-6000转/min，最优 选为 3500-4500转/min。
[0020] 在步骤(3)中，优选沉淀物1:生石灰：活性炭：乙醇水溶液的重量比为1:(0.075-0.5) :(0.05-0.3) :(5-15),更优选为 1:(0.1-0.3) :(0.075-0.2) :(6-12),最优选为 1:0.2: 0.15: (8-10)。优选乙醇水溶液的浓度为80-90%，最优选为约85%。优选加入生石灰后的回 流时间为1-lOh，更优选为2-化，最优选为约4h;回流溫度为70-90°C，更优选为75-85°C，最 优选为约79°C。优选加入活性炭后的回流时间为0.5-化，更优选为1-化，最优选为约化。优 选离屯、转速为2000-8000转/min，更优选为3000-6000转/min，最优选为3500-4500转/min。
[0021] 在步骤(4)中，优选强碱为氨氧化钢或氨氧化钟。优选沉淀物1:盐酸径胺:强碱的 重量比为 1:(0.1-0.5) :(0.25-1.25)，更优选为 1:(0.15-0.3) :(0.3-0.8)，最优选为约 1: 0.2:0.5。优选回流时间为2-1511，更优选为4-10}1，最优选为6-化。优选回流溫度为70-90°(3， 更优选为75-85°C，最优选为约79°C。优选离屯、转速为2000-8000转/min，更优选为3000-6000转/min，最优选为 3500-4500转/min。
[0022] 在步骤(6)中，优选沉淀物2:乙醇水溶液:盐酸水溶液的重量比为1:(2-15) :(0.2-5)，更优选为1: (3-10): (0.5-2)，最优选为1:巧-8): (1-1.6)。优选乙醇水溶液的浓度为90-98%，最优选为约95%。优选盐酸水溶液的浓度为0.8-1.2111〇1/1，最优选为约1111〇1/1。优选 回流时间为1 -12h，更优选为2-化，最优选为4-化。
[0023] 本领域技术人员能够理解，在步骤(5)和(6)中，可W使用各种本领域已知的结晶 或重结晶方法。例如:在步骤(5)中，可W将清液3调抑至中性，浓缩，冷却静置直至剑麻皂素 结晶不再析出，离屯、，将沉淀用水洗后干燥即得剑麻皂素，其中，优选用Imol/L的HC1水溶液 调抑;在步骤(6)中，将回流后的溶液调pH至6.5-7.0,蒸馈回收溶剂，将所得固体用热丙酬 溶解，冷却静置直至海柯吉宁结晶不再析出，离屯、，将沉淀