化21菌的生长浓度比其他的细菌对照生长浓度高。证明了 EPSPS基 因草甘麟耐受性的功能，即克隆的EPSPS是草甘麟耐受型基因，其基因表达产物可W解除 草甘麟对宿主细胞的毒性，并利用草甘麟生长。
【具体实施方式】
[0079] W下详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用W说明本发明的技术方案而 非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解， 可W对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围， 其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
[0080] 实施例1.草甘麟耐受菌株的分离
[0081] 在浙江省德清县附近的一个草甘麟生产厂周围±壤及污水中采样，用含有一定浓 度草甘麟的培养基进行有效分离，其中一个菌株可W分别在300mM，600mM和900mM草甘麟 限制性培养基上生长，选择此抗性菌株进行进一步研究。
[0082] 实施例2.草甘麟耐受菌株的鉴定
[008引运用细菌16s rDNA的通用引物，通过PCR获得部分16s rDNA序列。PCR产 物被克隆到PMD19-T质粒上后进行了测序。结果发现该菌株与Stenotrophomonas maltophilia(AY833408)有99%的同源性。因此该菌是一种茎菌属或柄细菌属，被命名为 A9。
[0084] 实施例3.具有草甘麟耐受性的EPSPS基因的分离、筛选、测序及分析 [008引 a)A9基因组总DNA的大量制备
[0086] 将A9菌株接种至含有900mM草甘麟及100ml Re化ced化lorine培养基（1L中含 有1. 826g磯酸氨二钟，0. 87g磯酸二氨钟，0. 66g磯酸氨二倭，0. 097g硫酸镇，0. 025g-水 合硫酸儘，0. 005g走水合硫酸亚铁和0.0 OOlg硫酸巧）的250ml锥形瓶中，3(TC摇床中W 20化pm振荡培养48小时，离必巧00化pm, 10分钟），将沉淀重悬于4. 67ml TE(p册.0)中，加 入300 μ 1 10% SDS，再加入30 μ 1 20mg/ml蛋白酶K。小必颠倒混匀，37°C水浴1小时。加 入等体积的酪，小必颠倒混匀，室温130(K)rpm离必10分钟，吸取出上层水相，再加入等体积 的氯仿/异戊醇（24 ;1)，混匀后室温1300化pm离必10分钟。取出上层水相后，加入1/10 体积3M NaAc (抑5. 5)及2倍体积的无水己醇，-2(TC沉淀30分钟。取出1300化pm离必10 分钟，去除上清液，沉淀中加入1ml 75%的己醇，10000巧m离必5分钟。弃去己醇，瞭干，加 入100 μ 1灭菌的去离子水溶解沉淀。0. 6%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。
[0087] b化PSPS基因扩增
[0088] 设计一对简并引物
[0089] 引物 3 巧PSPS-60F) ;5, -CCN GGN GAY AAR WSN AT-3，
[0090] 引物 4 巧PSPS-528R) ;5, -GC NSW YTT NAC YTG NGC-3，
[00川其中为 W(AT) ;Υ 为（CT) ;N 为（AT贿；S 为（GC) ;R 为（AG)。
[009引 WA9基因组DNA为模板，用引物3和引物4在BI0RAD PCR仪上进行PCR扩增反 应。反应体系为；0. 5μ 1 A9基因组0ΝΑ，2μ 1 10X K0D reaction buffer，2u 1 dNTP(2. 5mM each)，0. 8μ 1 M拆04(25mM)，0. 5μ 1 引物 1(10μΜ)，0. 5μ 1 引物 2(10μΜ)，0. 5μ 1 KOD polymeraseau/μ 1)，加水补至总体积20μ 1。反应条件为；95°C lOmin，然后W95°C 30s、 55°C 45s、68°C Imin进行35个循环，最后68°C延伸7min。得到一段约为45化p的片段。按 照PCR产物纯化试剂盒QIAquick Gel Extraction Kit的方法纯化PCR产物，测序。
[009引 C)序列测定及分析
[0094] 根据该序列测定的结果设计一个反向引物5 ;5' -GC CGA CTT CACCTG CGC C-3'， 用引物3与引物5再进行一次PCR，反应体系及反应条件同上，回收测序，并将序列命名为 A9-EPSPS-15-RP。
[0095] cOEPSPS基因组全长克隆
[0096] 依照Clontech的GenomeWa]_ke;r Universal Kite的方法，先构建两个限制性内切 酶的文库。分别取2ug的A9基因组DNA，各加入8μ 1限制性内切酶EcoRVaOU/μ 1)和 PvuII (10U/μ 1)于37°C消化16-18个小时，用等体积的酪抽提，取上清再用等体积的氯仿/ 异戊醇（24 ;1)抽提，取上清加入1/10体积3M NaAC(抑5. 5)及2倍体积的无水己醇，-2(TC 沉淀30分钟。取出1300化pm离必10分钟沉淀，去除上清液，加入75%的己醇，10000巧m离 必5分钟。弃去己醇，瞭干，加入20 μ 1灭菌的去离子水溶解沉淀。每个酶切产物取4. 8 μ 1， 加入 1. 9 μ 1 的 GenomeWa]_ker Adaptor (25 μ Μ)，0. 8 μ 1 10 X Ligation Buffer, 0. 5 μ 1 Τ4 DNA ligase化U/ μ 1)。混匀后于16°C连接12小时。取出后7(TC放置5分钟终止连接反 应，最后加入72μl去离子水至终体积80μl，获得A9的EcoRV和PvuΠ 两个文库。
[0097] 1) A犯PSPS 5'端序列扩增
[0098] 从序列A9-EPSPS-15-RP上设计2只反向引物
[0099] 引物 6(A9_EPSPS_328RP) ;5, -GCT GTC GCC CGT GAA GGTCGC CGC CAG-3'
[0100] 引物 7(A9_EPSPS_130RP) ;5, -CAC GTC GTC GCT CTC GAGCAG GCC GTC-3'
[010。 W EcoRV文库为模板，用Adaptor Primer 1与引物6配对进行第一轮PCR，反应 体系同a)的，反应条件为；95°C lOmin，然后W95°C 25s、68°C 3min进行7个循环，接着W 95°C 25s、63°C 30s、68°C 3min进行36个循环，最后68°C延伸7min。将第一轮产物稀释30 倍。W第一轮PCR的稀释产物为模板，用Adaptor Primer 2和引物7进行第二轮的PCR，反 应条件为 95°C lOmin，然后 W95°C 25s、68°C 3min 进行 5 个循环，接着 W95°C 25s、64°C 30s、 68°C 3min进行24个循环，最后68°C延伸7min。1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测获得长约65化p 的片段，按照PCR产物纯化试剂盒QIAquick Gel Extraction Kit的方法回收纯化PCR产 物，进行序列测定，命名为Ag-Nterm-oneseq。
[0102] 2)A9 EPSPS 3'端序列扩增
[0103] 从序列Ag-Nterm-oneseq上设计2只正向引物
[0104] 引物 8(A9_EPSPS_306FP) ;5, -GCC GGC ACC GGC GTG CGGCTG ATC ATG-3'
[0105] 引物 9(A9_EPSPS_501FP) ;5, -ATC GCC TAC CGC CTG CCCGAG CCC TCG-3'
[0106] W PvuII文库为模板，用Adaptor Primer 1与引物8配对进行第一轮PCR，用 Adaptor Primer 2与引物9配对进行第二轮PCR，反应体系及条件同上述5'端扩增。1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测，获得长约5(K)bp的片段，按照PCR产物纯化试剂盒QIAquick Gel Extraction Kit的方法回收纯化PCR产物，进行序列测定，命名为A9-Cterm oneseq-479F〇
[0107] 从序列Ag-Cterm oneseq-339F上设计两只正向引物
[0108] 引物 10 (A9-EPSPS-479F-423FP) ;5, -CGG GCC GGC GGG CGGCTG C-3，
[0109] 引物 11(A9-EPSPS-479F-534FP) ;5, -CTG AGC GCC GAC GGCGGC G-3'
[0110] W EcoRV文库为模板，用Adaptor Primer 1与引物10配对进行第一轮PCR,用 Adaptor Prim