粉碎，加16L甲醇溶液加热回流提取，每次2h，共提取 3次，合并提取液，减压回收溶剂至干，得甲醇提取物1130g。将甲醇提取物加500mL水，分散 溶解，依次用环己烷、乙酸乙酯萃取至溶液颜色明显变浅，将乙酸乙酯萃取液减压回收浓 缩，得乙酸乙酯萃取部位355g。此即为含人参皂苷人参花总皂苷（图1)，收率约8.8%。
[0049] (2)制备样品月父
[0050] 精确称取上述得到的人参花总皂苷5.242g，用30mL甲醇完全溶解，再加入11.061g 80~100目硅胶（用量约为总皂苷质量的2倍），在50°C的水浴蒸干，同时不断搅拌，勿使结 块，直至硅胶呈现出干燥不留手的粉末状态，置于干燥皿干燥，使之成为样品胶。
[0051 ] (3)制备分离胶
[0052] 称取101.368g 300~400目硅胶（用量约为总皂苷质量的20倍），用250mL氯仿充分 溶解，超声除气泡20min，同时不断搅拌，直至无大量气泡产生。
[0053] (4)洗脱
[0054] 采用硅胶柱层析，将分离胶均匀加至玻璃柱内，再把样品胶缓慢均匀加至分离胶 上层进行硅胶柱层析，分别以氯仿：甲醇:水的体积比为100:10:1，80:10:1，60:10:1，40: 10:1，20:10:1及10:10:1的混合液作为洗脱液，依次进行梯度洗脱，分别收集洗脱流份。 [0055] (5)薄层色谱(TLC)检测
[0056]薄层层析板选用薄层层析板Silica gel 602F254 ,德国Merck公司制品，展开剂选 用氯仿-甲醇-水(体积比为7:1:0.1)，显色剂选用5%H2S〇4_乙醇溶液。合并与人参皂苷Fdi 照品（人参皂苷Fd#照品，NIFDC提供)Rf值相同的流份溶液，在60:10:1洗脱流份中，人参皂 -Fi被洗脱出，再用旋转蒸发仪水浴(温度为50°C )旋干，得粗品人参皂苷Fi质量为0.726g， 放入干燥器中保存。
[0057] (6)柱层析法纯化人参皂-Fi
[0058] 将步骤(5)分离得到的人参皂苷F!粗品0.726g，用2mL 50 %甲醇水溶液完全溶解。 称取20.556g MCI GEL(F型75-150U，成都科谱生物有限公司）作为分离胶，用量约为样品质 量的30倍，50%甲醇装柱。先用50%甲醇洗脱2个柱体积以平衡柱子，然后用滴管沿着柱内 壁加样。依次用50 %甲醇，60 %甲醇，70 %甲醇混合液进行梯度洗脱，采用薄层色谱法检测， 发现60%甲醇洗脱液后半段有人参皂苷^洗脱出来，收集、合并与人参皂苷h阳性对照品Rf 值相同的流份溶液，用旋转蒸发仪(水浴温度为50 °C)旋干，得人参皂苷FiO. 589g。从人参花 总皂苷到分离纯化得到单体皂苷的总收率约11.2%。
[0059] 实施例2
[0060] (1)纯度检测
[0061]采用高效液相色谱(HPLC)法对经柱层析法纯化得到的人参皂苷?:进行检测，其纯 度为95.17%(图2)。色谱条件：色谱柱，Zorbax Eclipse XDB C-18(5ym;4.6mm i.d.X 250mm);流动相，甲醇：水体积比为60:40;流速，1. OmL/min;检测波长，203nm;进样量，20yL。 此色谱条件下，人参皂苷F!标准曲线回归方程为y = 2.428x-21.466，R = 0.9999;进样量在 0.3yg~20yg范围内具有良好的线性关系。
[0062] (2)人参皂-Fi的结构分析
[0063]采用高分辨质谱法和核磁共振波谱法，对经纯化后的产物进行了结构表征，获得 了人参皂苷F^MS和匪R波谱特征。选用的仪器为Orbi trap Elite质谱仪（Thermo Scientific,Bremen，Germany)和Bruker DRX-500型核磁共振仪（TMS作内标，C5D5N作溶剂）， 实验结果分析如下。
[0064]高分辨质谱图结果分析：
[0065]人参皂-Fi的高分辨质谱如图5所示。图谱中m/z 661.4279[M+Na] + (计算值 661.4291 ;C36H62〇9Na)，说明其分子式为C36H62O9,与结果相符合。
[0066]核磁共振波谱法结果分析：
[0067] 人参皂苷？1为白色无定形粉末，5%硫酸乙醇显色斑点呈紫色；1^1^遺&11-Bur chard反应阳性。
[0068] 在人参皂苷Fi的1H Mffi(C5D5N)(图3)和13C匪R(C5D5N)(图4)谱中可看到匪R (400MHz，C5D5N)Sl.00，1.04，1.12，1.47，1.62，1.62，1.64,2.00(each 3H，s，CH3)，芳香区δ 5.26(1!1，^ = 6.1抱，!1-24)为!1-24双键上的特征信号。此外55.20(1!1，(1，1 = 6.4抱）为葡萄 糖基的端基氢信号。13C匪R(100MHz，C5D5N)谱中共给出36个碳信号，其中30个碳信号为苷 元，经与文献对照，为20(S)_原人参三醇。其余6个信号为葡萄糖基信号：δ98.28,78.51， 78.25,75.16,71.78,62.99</ 3C NMR(100MHz，C5D5N)数据见下表。
[0069]
[0070]
[0071] 经过上述检测数据证明，本发明所获的样品为人参皂苷Fi，其分子结构为（I)即本 发明中所指的人参皂苷^化学结构；
[0072]
[0073] 本发明通过下面的药效学实验进一步说明其抗肿瘤作用。
[0074] 实施例3
[0075] MTT(四唑盐)法测定人参皂-Fi对人肿瘤细胞的杀伤作用。
[0076] (1)试验设计
[0077] 使用的肿瘤细胞株:A549人非小细胞肺癌细胞、MGC80-3人胃癌细胞、MCF-7人乳腺 癌细胞三种人肿瘤细胞系(采用的细胞培养液分别为RPMI 1640培养液、DMEM培养液、MEM培 养液)。
[0078] 试验分组：
[0079] 人参皂苷卩!组：1、25、50、100、200yg/L;
[0080] 人参皂苷 Rg3组：1、25、50、100、200yg/L;
[0081 ]空白对照组:细胞培养液；
[0082] 溶剂对照组:细胞培养液及DMSO;
[0083] 阳性对照组：5-氟尿嘧啶（10yg/L)
[0084] (2)方法
[0085] 取对数生长期细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，60(^/11^11离心1〇1^11，调整细胞浓 度为6 X 104个/mL，接种于96孔培养板中（边缘孔用无菌PBS填充），每孔90yL。培养24h后，加 入样品人参皂-Fi(样品溶解于DMS0中，用培养基逐步稀释，加入细胞中药液的DMS0终浓度 低于1 % )，使细胞液终浓度达到1、25、50、100、200yg/L，每组均设3个平行孔。于37°C5%C02 培养箱共同培养48h。每孔加入20yL MTT溶液(5mg/mL，溶解于roS中），继续培养4h后，终止 培养。小心吸弃上清液，每孔加入150yL DMS0，震荡1 Omin，使结晶物充分溶解。用酶标仪在 570nm处测每孔的吸光值(A)，计算出细胞存活率:细胞存活率％ =加样品A值/对照细胞A值 X100%〇
[0086] ⑶结果
[0087] 实验结果表明，人参皂苷Fi对三种人肿瘤细胞系均具有较强的细胞杀伤作用。结 果见图6。与人参皂苷Rg3相比，作用明显增强。结果见表1-3。
[0088]表1对A549人非小细胞肺癌细胞的影响
[0089]
[0090] 表2对MGC80-3人胃癌细胞的影响 [0091]
[0092] 表3对MCF-7人乳腺癌细胞的影响
[0093]
[0094] 综上所述，目前，我们发现人参皂苷Fi单体是人参花中含量较高的一种具抗肿瘤 活性的皂苷成分，随着单体化合物制剂的发展趋势，其在抗肿瘤药物研发中具有广阔前景。 本发明是从人参花甲醇提取物的总皂苷中分离，纯化出单体人参皂-Fi。本发明的工艺易 于操作，收率高，纯度高，不易引入有毒物质，无毒副作用及药物依赖性，人参皂苷Fi单体可 以广泛应用于抗肿瘤药物或药物组合物中。
【主权项】
1. 一种从人参花中提取、制备人参皂-Fi的方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 称取新鲜干燥后的人参花，粉碎； (2) 加入3-5倍重量的甲醇，加热回流提取2h，提取3-5次，离心过滤，去除残渣，得滤液； (3) 将滤液在50°C以下减压浓缩，制成浸膏或干粉，回收溶剂甲醇； (4) 在浸膏或干粉中加入0.2-0.5倍重量的水，分散溶解，依次用环己烷、乙酸乙酯萃 取，回收乙酸乙酯萃取液，减压浓缩得到人参花总皂苷； (5) 先将人参花总皂苷样品溶解于甲醇中与2-4倍重量的80~100目硅胶搅拌混匀，水 浴蒸干，制得样品胶;然后取人参花总皂苷质量15-25倍重量的300~400目硅胶，用氯仿充 分溶解，制得硅胶分离胶，再把样品胶缓慢均匀加至分离胶上层进行硅胶柱层析，分别以氯 仿：甲醇:水的体积比为100:10:1，80:10:1，60:10:1，40:10:1，20:10:1及10:10:1的混合液 作为洗脱液，依次进行梯度洗脱，分别收集洗脱流份的同时，采用薄层色谱法检测，收集、合 并与人参皂苷F!阳性对照品Rf值相同的流份溶液;减压浓缩回收溶剂后进行MCI GEL柱层 析，依次用50%甲醇，60 %甲醇，70 %甲醇混合液进行梯度洗脱，收集、合并与人参皂苷h阳 性对照品Rf值相同的流份溶液，用旋转蒸发仪旋干得人参皂苷h单体。2. 根据权利要求1所述提取方法，其特征在于:步骤(2)中，甲醇含量为98%-100%。3. 根据权利要求1所述提取方法，其特征在于：步骤(4)中得到的人参花总皂苷中人参 皂苷Fi含量为10%-15%。4. 根据权利要求1所述提取方法，其特征在于:步骤(5)中，旋转蒸发仪浓缩的水浴温度 为 40°C_50°C。5. 根据权利要求1所述提取方法，其特征在于:步骤(5)中，MCI GEL柱层析所用的填料 为MCI GEL F型，粒度75-150u。6. 根据权利要求1所述提取方法，其特征在于:步骤(5)中得到的人参皂苷h单体纯度为 不低于95.17%。7. 如权利要求1-5所述方法得到的人参皂苷Fi单体对人肺癌细胞、人胃癌细胞、人乳腺 癌细胞的杀伤和抑制作用。8. 如权利要求1-5所述方法得到的人参皂苷h单体在制备抗肿瘤药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开一种人参皂苷的提取纯化方法和其药物用途，具体涉及抗肿瘤有效成分人参皂苷F1的分离、纯化方法。本发明以人参花为原料，将其用甲醇提取，环己烷、乙酸乙酯依次萃取后，将乙酸乙酯萃取物经过硅胶柱层析和MCI？GEL柱层析，得到人参皂苷F1单体。具有制备工艺易于操作，收率高，纯度高，不引入有毒物质，成本低廉等特点，产品在抗肿瘤药物中具有广泛用途。
【IPC分类】C07J17/00, A61P35/00
【公开号】CN105601693
【申请号】CN201510695791
【发明人】李珂珂, 弓晓杰, 陈丽荣, 徐斐
【申请人】大连大学
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2015年10月22日