谱柱分离，得到化-切S-I， 产率为41%。
[0028] 实施例2 化-切S-2的合成:将10毫摩尔的1-径基-3,4二氯苯乙酬和10毫摩尔的2-醒基嚷吩加入 20毫升乙醇中，然后滴加入20毫升的质量分数为30%的氨氧化钟溶液，滴加完毕后室溫揽拌 10小时;揽拌后将反应液冷却，缓慢滴加15毫升质量分数为30%的双氧水溶液，室溫揽拌24 小时，用浓度为1摩尔/升的稀盐酸中和，将沉淀过滤干燥后，在乙醇中重结晶，获得中间产 物;再将5毫摩尔的中间体加入10毫升干燥的二氯甲烧中，加入2毫升的=乙胺，在冰水浴中 缓慢滴加2毫升丙締酷氯，反应半小时后，继续在室溫下反应4小时，加入20毫升的碳酸钢饱 合水溶液，用二氯甲烧萃取后加入无水硫酸钢干燥，浓缩后利用凝胶色谱柱分离，得到化- Cys-2,产率为 27%。
[0029] 实施例3 化-切s-3的合成:将10毫摩尔的1-?基-4-?甲基苯乙酬和10毫摩尔的2-醒基嚷吩加 入20毫升乙醇中，然后滴加入20毫升的质量分数为30%的氨氧化钟溶液，滴加完毕后室溫揽 拌10小时;揽拌后将反应液冷却，缓慢滴加15毫升30%的双氧水溶液，室溫揽拌24小时，用浓 度为1摩尔/升的稀盐酸中和，将沉淀过滤干燥后，在乙醇中重结晶，获得中间产物;再将5毫 摩尔的中间体加入10毫升干燥的二氯甲烧中，加入1毫升的=乙胺，在冰水浴中缓慢滴加2 毫升丙締酷氯，反应半小时后，继续在室溫下反应12小时，加入20毫升的碳酸钢饱合水溶 液，用二氯甲烧萃取后加入无水硫酸钢干燥，浓缩后利用凝胶色谱柱分离，得到化-切S-3， 产率为15%。
[0030] 实施例4 化-切S-4的合成:将10毫摩尔的1-径基-3-径甲基苯乙酬和10毫摩尔的2-醒基嚷吩加 入20毫升乙醇中，然后滴加入20毫升的质量分数为30%的氨氧化钟溶液，滴加完毕后室溫揽 拌10小时;将反应液冷却，缓慢滴加15毫升30%的双氧水溶液，室溫揽拌24小时，用浓度为1 摩尔/升的稀盐酸中和，将沉淀过滤干燥后，在乙醇中重结晶，获得中间产物;再将5毫摩尔 的中间体加入10毫升干燥的二氯甲烧中，加入1毫升的=乙胺，在冰水浴中缓慢滴加2毫升 丙締酷氯，反应半小时后，继续在室溫下反应12小时，加入20毫升的碳酸钢饱合水溶液，用 二氯甲烧萃取后加入无水硫酸钢干燥，浓缩后利用凝胶色谱柱分离，得到化-切S-4，产率为 11〇/〇。
[0031] 2、检测试剂的生物毒性 由于检测试剂主要用于生物样本检测，因此低细胞毒性是衡量检测试剂实用性的重要 指标之一。本发明采用MlT方法，将密度为IO4CelVcm2的人类厮静脉内皮细胞化UVECs)在12 孔细胞培养皿连续培养24小时，分=组分别滴加入浓度为5yM的四种检测试剂继续培养24 小时，最后按照吸光度计算细胞存活率。结果从图1可W看出，。心切3-2没有明显的细胞毒 性，而其它S种检测试剂的毒性偏大，因而优选化-Cys-2进行进一步的测试。
[0032] 3、检测试剂。心〔73-2对氨基酸的选择性试验 取20微升的ImM浓度的化-切S-2加入石英比色皿中，加入2mL乙腊与水的混合溶液（乙 腊:水=5:5，0.1 mM的肥PES缓冲溶液，pH=7.4)，向比色皿中分别滴加20微升的ImM浓度的甘 氨酸、赖氨酸、谷氨酸、色氨酸、丝氨酸、丙氨酸、高脫氨酸W及半脫氨酸水溶液，如图2所示， 在400纳米光的激发下，。心切3-2对半脫氨酸的巧光增强倍数达到20W上，而对其它氨基酸 的巧光响应都比较小，表明该检测试剂化-Cys-2能够选择性的检测半脫氨酸。
[0033] 4、检测试剂。心〔73-2对活细胞内半脫氨酸的检测成像 将5yM的化-Cys-2滴入人类厮静脉内皮细胞的培养液中，1小时后用巧光显微镜可W观 测到巧光染料成功的将细胞染色，如图3所示。说明化-切S-2在细胞内高浓度的半脫氨酸下 巧光增强。
[0034] 而当细胞经过N-乙基马来酷亚胺处理后，半脫氨酸会与N-乙基马来酷亚胺的碳碳 双键反应，使细胞内半脫氨酸的浓度降低。此时再用5yM的化-切S-2染色一小时，如图4所 示，细胞的巧光强度明显低于图3,验证了细胞内半脫氨酸的浓度降低。W上实验结果证明 FkCys-2能够对活细胞中半脫氨酸实现巧光成像。
[0035] 综上所述，本发明提供的一种半脫氨酸检测试剂及其制备方法，本发明的上述检 测试剂不具有生物毒性，且对半脫氨酸的灵敏性较高，能够选择性的检测半脫氨酸，能够对 细胞内的半脫氨酸实现巧光检测，达到商品化应用要求。
[0036] 应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可 W根据上述说明加 W改进或变换，所有运些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保 护范围。
【主权项】
1. 一种半胱氨酸检测试剂，其特征在于，所述半胱氨酸检测试剂具有如下所示的结构 通式：其中:Ri 为H、C1 或 OCH3;R2 为H、C1 或 OCH3。2. -种如权利要求1所述的半胱氨酸检测试剂的制备方法，其特征在于，包括步骤： A、 将含心和此取代基的临羟基苯乙酮和2-醛基噻吩加入溶剂中，然后滴加入氢氧化钾 溶液，滴加完毕后室温搅拌8~12小时;搅拌后将反应液冷却，缓慢滴加双氧水溶液，室温搅 拌20~25小时，用稀酸中和，将沉淀过滤干燥后，重结晶，获得中间体； B、 将中间体加入干燥的二氯甲烷中，加入三乙胺，在冰水浴中缓慢滴加丙烯酰氯，反应 20~40分钟后，继续在室温下反应4-20小时，加入碳酸钠饱合水溶液，萃取后干燥，浓缩后分 离。3. 根据权利要求2所述的半胱氨酸检测试剂的制备方法，其特征在于，步骤A中，含心和 R2取代基的临羟基苯乙酮和2-醛基噻吩加入的摩尔比为1: (1~3)。4. 根据权利要求3所述的半胱氨酸检测试剂的制备方法，其特征在于，步骤A中，溶剂为 乙醇，乙醇的加入量为10~50毫升。5. 根据权利要求2所述的半胱氨酸检测试剂的制备方法，其特征在于，步骤A中，氢氧化 钾的质量分数浓度为1 〇~40%。6. 根据权利要求2所述的半胱氨酸检测试剂的制备方法，其特征在于，步骤A中，双氧水 的加入量为5-30毫升，双氧水的质量分数浓度为20~40%。7. 根据权利要求2所述的半胱氨酸检测试剂的制备方法，其特征在于，步骤A中，在乙醇 中重结晶。8. 根据权利要求2所述的半胱氨酸检测试剂的制备方法，其特征在于，步骤B中，萃取后 加入无水硫酸钠干燥。9. 根据权利要求2所述的半胱氨酸检测试剂的制备方法，其特征在于，步骤B中，浓缩后 利用凝胶色谱柱分离。10. 根据权利要求9所述的半胱氨酸检测试剂的制备方法，其特征在于，凝胶色谱柱分 离时的洗脱剂为二氯甲烷。
【专利摘要】本发明公开一种半胱氨酸检测试剂及其制备方法，其中，所述半胱氨酸检测试剂具有如下所示的结构通式：；其中：R1为H、Cl或OCH3；R2为H、Cl或OCH3。本发明的上述检测试剂不具有生物毒性，且对半胱氨酸的灵敏性较高，能够选择性的检测半胱氨酸，能够对细胞内的半胱氨酸实现荧光检测，达到商品化应用要求。
【IPC分类】C07D409/04, C09K11/06, G01N21/64
【公开号】CN105669661
【申请号】CN201610145156
【发明人】刘斌
【申请人】深圳大学
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年3月14日